引用本文： 李文博, 曹靖靖, 寇振宇, 韩菲菲, 刘爱华, 东莉洁. 聚嘧啶束结合蛋白相关剪接子高表达对人视网膜微血管内皮细胞凋亡和内质网氧化应激损伤的保护作用. 中华眼底病杂志, 2023, 39(8): 681-686. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20210119-00033 复制
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氧化应激（OS）是指细胞内氧化成分和抗氧化成分之间的失衡，在视网膜内皮细胞中，OS可诱导内皮细胞功能障碍[1]，从而在眼内各种血管性疾病中发挥重要的作用。视网膜血管性疾病是由眼部或全身性血管疾病引发的视网膜出血、渗出、水肿、缺血或梗死，严重者可引发失明。目前临床中治疗视网膜血管性疾病主要通过使用抗血管内皮生长因子（VEGF）药物，但由此引发的纤维化等并发症将进一步加重疾病的进展[2]。内质网（ER）是参与蛋白质翻译和加工的重要细胞器，过量的活性氧（ROS）通过干扰蛋白质翻译和加工之间的平衡而引起ER应激，最终导致细胞凋亡。4-羟基壬烯醛（4-HNE）作为脂质过氧化/OS的重要标志，因高浓度4-HNE可以破坏信号转导和蛋白质活性，诱导炎症并触发细胞凋亡[3]，而在模拟OS的实验研究中被广泛应用。有研究报道4-HNE可诱导人视网膜色素上皮（RPE）19细胞释放VEGF，加速老年性黄斑变性（AMD）进展[4]。聚嘧啶束结合蛋白相关剪切子（PSF）是一种多功能蛋白，在DNA修复、RNA转录等方面发挥重要作用[5]。我们前期研究发现，过量ROS对视网膜Müller细胞、RPE细胞和血管内皮细胞均有不良影响[6-8]。本研究应用高浓度4-HNE建立人视网膜微血管内皮细胞（hRMEC）氧化应激模型，探讨PSF对其ROS产生的影响并初步探讨潜在机制，以期为治疗视网膜血管性疾病探索新的治疗靶点。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
hRMEC购自北京北纳科技有限公司[1]；4-HNE（美国Sigma公司）；膜联蛋白（Annexin）Ⅴ/碘化丙啶凋亡试剂盒、2'，7'-二氯二氢荧光素双乙酸盐（DCFH-DA）（美国Sigma公司）。
1.2 方法
细胞分组。对数生长期hRMEC分为正常组、单纯4-HNE处理组（单纯4-HNE组）、空载质粒联合4-HNE处理组（Vec+4-HNE组）、PSF高表达联合4-HNE处理组（PSF+ 4-HNE组）。单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组细胞培养基加入10 μmol/L 4-HNE，刺激12 h。其后，Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组应用转染试剂脂质体2000分别导入pcDNA空载体、pcDNA-PSF真核表达质粒，转染24 h。正常组细胞常规培养。
流式细胞仪检测hRMEC凋亡率。根据分组对细胞进行相应培养，消化离心并弃去上清液，分别用500 μl磷酸盐缓冲液（PBS）重悬成单细胞悬液，加入10 μl AnnexinV/荧光素异硫氰酸酯冰上避光孵育15 min；加入400 μl结合缓冲液、5 μl PI冰上避光孵育5 min；混匀流式细胞仪检测细胞凋亡率。每组样品设置3个副孔，每孔获取50 000个微粒信号，实验重复3次，检测结果通过Flowjo7.6软件进行分析。
DCFH-DA探针检测PSF高表达对hRMEC内ROS表达的影响。单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组细胞与含有10 μmol/L DCFH-DA的无血清培养基于37 °C下孵育30 min，PBS洗涤2次。采用荧光显微镜拍摄图像，观察ROS表达情况；通过Image J分析荧光强度。
蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测正常组、单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组hRMEC内的ER氧化物蛋白1（Ero-1）、蛋白质二硫键异构酶（PDI）、C/EBP同源转录因子（CHOP）、葡萄糖调节蛋白（GRP）78、蛋白激酶R样ER激酶（PERK）/磷酸化PERK（p-PERK）、真核起始因子（eIF）2α/磷酸化eIF（peIF）、活化转录因子4（ATF4）蛋白相对表达量。收集各组细胞总蛋白，调整蛋白浓度。每个样孔加入60 μg待测样品，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中上样电泳；80 V 恒压0.5 h，样品进入分离胶后100 V恒压2 h，进行蛋白分离。将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜，90 V恒压100 min。5％脱脂牛奶封闭1 h，与特定一抗 4℃孵育过夜。PBS洗膜，加入1∶5 000稀释的山羊抗兔IgG 辣根过氧化物室温孵育2 h。化学发光试剂盒显色，以磷酸甘油醛脱氢酶为内参照，多光谱成像系统扫描蛋白条带并应用Image J进行半定量分析。
1.3 统计学处理
采用SPSS22.0软件进行统计分析。计量数据以均数±标准差（x±s）表示。组间比较采用单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 PSF蛋白抑制4-HNE诱导的hRMEC凋亡
流式细胞仪检测结果显示，单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组细胞凋亡率分别为（22.50±0.58）%、（26.93±0.55）%、（11.70±0.17）%；三组间细胞凋亡率比较，差异有统计学意义（F=24.531，P＜0.05）（图1）。
图1
各组hRMEC凋亡率比较（n=3） 1A～1D分别示正常组、单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组流式细胞仪检测像；1E示4组细胞凋亡率比较，1、2、3、4分别为正常组、单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组；*P＜0.05 PSF：聚嘧啶束结合蛋白相关剪切子；4-HNE：4-羟基壬烯醛；hRMEC：人视网膜微血管内皮细胞；Annexin-V：膜联蛋白-V；PI：碘化丙啶
2.2 PSF蛋白抑制4-HNE诱导的ROS产生
DCFH-DA探针检测结果显示，单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组细胞内ROS表达量分别为0.23±0.03、1.60±0.06、0.50±0.06；Vec+4-HNE组ROS表达水平较单纯4-HNE组、PSF+4-HNE组显著升高，差异有统计学意义（F=37.274，P＜0.05）（图2）。
图2
各组hRMEC内ROS表达水平比较（n=3） 2A～2D分别示正常组、单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组荧光显微镜像（×20）；2E示4组ROS表达水平比较，1、2、3、4分别为正常组、单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组；*P＜0.05 PSF：聚嘧啶束结合蛋白相关剪切子；4-HNE：4-羟基壬烯醛；hRMEC：人视网膜微血管内皮细胞；ROS：活性氧
2.3 4-HNE处理后PSF上调Ero-1α、PDI表达
Western blot检测结果显示，正常组、单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组细胞ER中Ero-1、PDI蛋白相对表达量分别为1.25±0.03、0.45±0.03、0.63±0.03、1.13±0.09和1.00±0.10、0.27±0.10、0.31±0.05、0.80±0.06；4组Ero-1、PDI蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（F=43.164、36.643，P＜0.05）（图3）。
图3
各组hRMEC内Ero-1α、PDI蛋白相对表达量比较（n=3） 3A示Ero-1，*P＜0.05；3B示PD1，1、2、3、4分别为正常组、单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组；*P＜0.05 PSF：聚嘧啶束结合蛋白相关剪切子；4-HNE：4-羟基壬烯醛；hRMEC：人视网膜微血管内皮细胞；Ero-1：内质网氧化物蛋白1；PDI：蛋白质二硫键异构酶
2.4 PSF下调4HNE诱导的CHOP、GRP78表达
Western blot检测结果显示，正常组、单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组细胞ER中CHOP、GRP78蛋白相对表达量分别为0.55±0.06、1.13±0.09、0.90±0.06、0.48±0.04和0.48±0.04、1.25±0.03、1.03±0.09、0.50±0.06；4组CHOP、GRP78蛋白相对表达量比较，差异均有有统计学意义（F=42.855、45.275，P＜0.05）（图4）。
图4
各组hRMEC内CHOP、GRP78蛋白相对表达量比较（n=3） 4A示CHOP，*P＜0.05；4B示GRP78，1、2、3、4分别为正常组、单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组，*P＜0.05 PSF：聚嘧啶束结合蛋白相关剪切子；4-HNE：4-羟基壬烯醛；hRMEC：人视网膜微血管内皮细胞；CHOP：C/EBP同源转录因子；GRP78：葡萄糖调节蛋白78
2.5 PSF下调4-HNE作用下PERK/eIF2α/ATF4的信号活化水平
Western blot检测结果显示，正常组、单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组细胞ER p-PERK/PERK、peIF2α/eIF、ATF4蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表1）。
表1
4组hRMEC ER p-PERK/PERK、peIF2α/eIF、ATF4蛋白相对表达量比较（x±s）
3 讨论
4-HNE是脂质过氧化作用的终产物之一。生理条件下，4-HNE在血浆中的浓度极低，而细胞中则较高，但其浓度可以响应OS而增加100倍[9]。4-HNE可以通过修饰蛋白质的组氨酸、半胱氨酸和赖氨酸残基，形成HNE-蛋白质加合物参与细胞周期停滞，细胞分化和细胞死亡的调节[10]。既往文献报道，4-HNE的积累多与年龄相关性疾病相关，包括阿尔茨海默病、帕金森病、癌症等[11-13]。有研究显示，AMD患者血浆及视网膜中4-HNE水平均显著增高[14]。Sharma等[15]研究发现，4-HNE可以诱导RPE细胞中p53激活、磷酸化及核累积。因此本研究选择4-HNE作为诱导剂以模拟hRMEC的OS状态。
ER是细胞内合成蛋白质部位，负责蛋白质的折叠，生物合成，转运和翻译后修饰等过程。ER作为一个动态的细胞器，调控着几乎所有膜蛋白和大多数分泌蛋白的折叠和翻译后成熟。ER合成的蛋白质，需要通过蛋白质二硫键异构酶（PDI）家族和其他氧化还原酶介导形成二硫键才能获得特定的三维结构来发挥功能，并且ER中ROS的产生和消耗也有PDI的参与[16]。PDI对于维持ER稳态具有重要作用。研究发现，ER稳态一旦遭到破坏就会引起不正确蛋白质折叠，最终导致ER应激。而PDI在应激条件下可以防止蛋白质的蓄积，并且在珠蛋白的核心区维持疏水囊，从而抑制未折叠的蛋白效应（UPR）[17]。在生理条件下，免疫球蛋白重链结合蛋白/GRP78是正常细胞ER未折叠蛋白反应的主要调控因子[18]，而在应激条件下，GRP78在细胞膜上的过度表达介导大量蛋白质紊乱，促进细胞损伤凋亡。当ER稳态一旦受到破坏时，ER内的未折叠蛋白大量增加并聚集在ER上，引发UPR，进而激发内质网PERK/eIF2α/ATF4信号级联[19]，促进细胞凋亡，并且，作为ER应激诱导细胞凋亡的主要促凋亡基因，诱导的UPR调节CHOP在ER应激反应中也发挥着重要作用[20]。
PSF是细胞核内重要的调节蛋白，在修复DNA损伤，调节RNA转录等方面发挥重要作用[5]。在本研究中，我们发现4-HNE诱导细胞内Ero-1α/PDI降低，使得大量的未折叠的蛋白质聚集在ER上，大量未折叠蛋白质聚集引起GRP78表达增加，引发UPR。此外，我们发现4-HNE作用下ER PERK/eIF2α/ATF4信号通路也被激活，进一步导致UPR。UPR一方面导致ER氧化还原紊乱和ER应激反应，引起ER功能障碍进而导致细胞受损凋亡；另一方面UPR诱导CHOP表达引起细胞凋亡。而当PSF作用于受4-HNE诱导的hRMEC时，GRP78和CHOP表达下降，Ero-1/PDI表达增加。此外，我们观察到PERK，eIF的磷酸化及ATF4蛋白表达受到PSF抑制，从而导致PERK/eIF2a/ATF4信号通路激活受阻，提示PSF蛋白对OS状态下ER的保护作用。
本研究旨在以ER为切入点解读PSF对hRMEC OS的调控作用，并明确PSF作为潜在抗氧化剂其发挥作用的分子机制，为眼内OS相关性疾病的治疗提供新的可能靶点，目前我们的研究仅在细胞中进行了验证，PSF在体内的安全性及有效性尚需进一步明确。接下来我们将开展体内实验探究PSF的安全性及有效性，旨在全面掌握PSF对于眼内OS相关性疾病治疗的重要性。
氧化应激（OS）是指细胞内氧化成分和抗氧化成分之间的失衡，在视网膜内皮细胞中，OS可诱导内皮细胞功能障碍[1]，从而在眼内各种血管性疾病中发挥重要的作用。视网膜血管性疾病是由眼部或全身性血管疾病引发的视网膜出血、渗出、水肿、缺血或梗死，严重者可引发失明。目前临床中治疗视网膜血管性疾病主要通过使用抗血管内皮生长因子（VEGF）药物，但由此引发的纤维化等并发症将进一步加重疾病的进展[2]。内质网（ER）是参与蛋白质翻译和加工的重要细胞器，过量的活性氧（ROS）通过干扰蛋白质翻译和加工之间的平衡而引起ER应激，最终导致细胞凋亡。4-羟基壬烯醛（4-HNE）作为脂质过氧化/OS的重要标志，因高浓度4-HNE可以破坏信号转导和蛋白质活性，诱导炎症并触发细胞凋亡[3]，而在模拟OS的实验研究中被广泛应用。有研究报道4-HNE可诱导人视网膜色素上皮（RPE）19细胞释放VEGF，加速老年性黄斑变性（AMD）进展[4]。聚嘧啶束结合蛋白相关剪切子（PSF）是一种多功能蛋白，在DNA修复、RNA转录等方面发挥重要作用[5]。我们前期研究发现，过量ROS对视网膜Müller细胞、RPE细胞和血管内皮细胞均有不良影响[6-8]。本研究应用高浓度4-HNE建立人视网膜微血管内皮细胞（hRMEC）氧化应激模型，探讨PSF对其ROS产生的影响并初步探讨潜在机制，以期为治疗视网膜血管性疾病探索新的治疗靶点。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
hRMEC购自北京北纳科技有限公司[1]；4-HNE（美国Sigma公司）；膜联蛋白（Annexin）Ⅴ/碘化丙啶凋亡试剂盒、2'，7'-二氯二氢荧光素双乙酸盐（DCFH-DA）（美国Sigma公司）。
1.2 方法
细胞分组。对数生长期hRMEC分为正常组、单纯4-HNE处理组（单纯4-HNE组）、空载质粒联合4-HNE处理组（Vec+4-HNE组）、PSF高表达联合4-HNE处理组（PSF+ 4-HNE组）。单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组细胞培养基加入10 μmol/L 4-HNE，刺激12 h。其后，Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组应用转染试剂脂质体2000分别导入pcDNA空载体、pcDNA-PSF真核表达质粒，转染24 h。正常组细胞常规培养。
流式细胞仪检测hRMEC凋亡率。根据分组对细胞进行相应培养，消化离心并弃去上清液，分别用500 μl磷酸盐缓冲液（PBS）重悬成单细胞悬液，加入10 μl AnnexinV/荧光素异硫氰酸酯冰上避光孵育15 min；加入400 μl结合缓冲液、5 μl PI冰上避光孵育5 min；混匀流式细胞仪检测细胞凋亡率。每组样品设置3个副孔，每孔获取50 000个微粒信号，实验重复3次，检测结果通过Flowjo7.6软件进行分析。
DCFH-DA探针检测PSF高表达对hRMEC内ROS表达的影响。单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组细胞与含有10 μmol/L DCFH-DA的无血清培养基于37 °C下孵育30 min，PBS洗涤2次。采用荧光显微镜拍摄图像，观察ROS表达情况；通过Image J分析荧光强度。
蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测正常组、单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组hRMEC内的ER氧化物蛋白1（Ero-1）、蛋白质二硫键异构酶（PDI）、C/EBP同源转录因子（CHOP）、葡萄糖调节蛋白（GRP）78、蛋白激酶R样ER激酶（PERK）/磷酸化PERK（p-PERK）、真核起始因子（eIF）2α/磷酸化eIF（peIF）、活化转录因子4（ATF4）蛋白相对表达量。收集各组细胞总蛋白，调整蛋白浓度。每个样孔加入60 μg待测样品，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中上样电泳；80 V 恒压0.5 h，样品进入分离胶后100 V恒压2 h，进行蛋白分离。将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜，90 V恒压100 min。5％脱脂牛奶封闭1 h，与特定一抗 4℃孵育过夜。PBS洗膜，加入1∶5 000稀释的山羊抗兔IgG 辣根过氧化物室温孵育2 h。化学发光试剂盒显色，以磷酸甘油醛脱氢酶为内参照，多光谱成像系统扫描蛋白条带并应用Image J进行半定量分析。
1.3 统计学处理
采用SPSS22.0软件进行统计分析。计量数据以均数±标准差（x±s）表示。组间比较采用单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 PSF蛋白抑制4-HNE诱导的hRMEC凋亡
流式细胞仪检测结果显示，单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组细胞凋亡率分别为（22.50±0.58）%、（26.93±0.55）%、（11.70±0.17）%；三组间细胞凋亡率比较，差异有统计学意义（F=24.531，P＜0.05）（图1）。
图1
各组hRMEC凋亡率比较（n=3） 1A～1D分别示正常组、单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组流式细胞仪检测像；1E示4组细胞凋亡率比较，1、2、3、4分别为正常组、单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组；*P＜0.05 PSF：聚嘧啶束结合蛋白相关剪切子；4-HNE：4-羟基壬烯醛；hRMEC：人视网膜微血管内皮细胞；Annexin-V：膜联蛋白-V；PI：碘化丙啶
2.2 PSF蛋白抑制4-HNE诱导的ROS产生
DCFH-DA探针检测结果显示，单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组细胞内ROS表达量分别为0.23±0.03、1.60±0.06、0.50±0.06；Vec+4-HNE组ROS表达水平较单纯4-HNE组、PSF+4-HNE组显著升高，差异有统计学意义（F=37.274，P＜0.05）（图2）。
图2
各组hRMEC内ROS表达水平比较（n=3） 2A～2D分别示正常组、单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组荧光显微镜像（×20）；2E示4组ROS表达水平比较，1、2、3、4分别为正常组、单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组；*P＜0.05 PSF：聚嘧啶束结合蛋白相关剪切子；4-HNE：4-羟基壬烯醛；hRMEC：人视网膜微血管内皮细胞；ROS：活性氧
2.3 4-HNE处理后PSF上调Ero-1α、PDI表达
Western blot检测结果显示，正常组、单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组细胞ER中Ero-1、PDI蛋白相对表达量分别为1.25±0.03、0.45±0.03、0.63±0.03、1.13±0.09和1.00±0.10、0.27±0.10、0.31±0.05、0.80±0.06；4组Ero-1、PDI蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（F=43.164、36.643，P＜0.05）（图3）。
图3
各组hRMEC内Ero-1α、PDI蛋白相对表达量比较（n=3） 3A示Ero-1，*P＜0.05；3B示PD1，1、2、3、4分别为正常组、单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组；*P＜0.05 PSF：聚嘧啶束结合蛋白相关剪切子；4-HNE：4-羟基壬烯醛；hRMEC：人视网膜微血管内皮细胞；Ero-1：内质网氧化物蛋白1；PDI：蛋白质二硫键异构酶
2.4 PSF下调4HNE诱导的CHOP、GRP78表达
Western blot检测结果显示，正常组、单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组细胞ER中CHOP、GRP78蛋白相对表达量分别为0.55±0.06、1.13±0.09、0.90±0.06、0.48±0.04和0.48±0.04、1.25±0.03、1.03±0.09、0.50±0.06；4组CHOP、GRP78蛋白相对表达量比较，差异均有有统计学意义（F=42.855、45.275，P＜0.05）（图4）。
图4
各组hRMEC内CHOP、GRP78蛋白相对表达量比较（n=3） 4A示CHOP，*P＜0.05；4B示GRP78，1、2、3、4分别为正常组、单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组，*P＜0.05 PSF：聚嘧啶束结合蛋白相关剪切子；4-HNE：4-羟基壬烯醛；hRMEC：人视网膜微血管内皮细胞；CHOP：C/EBP同源转录因子；GRP78：葡萄糖调节蛋白78
2.5 PSF下调4-HNE作用下PERK/eIF2α/ATF4的信号活化水平
Western blot检测结果显示，正常组、单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组细胞ER p-PERK/PERK、peIF2α/eIF、ATF4蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表1）。
表1
4组hRMEC ER p-PERK/PERK、peIF2α/eIF、ATF4蛋白相对表达量比较（x±s）
3 讨论
4-HNE是脂质过氧化作用的终产物之一。生理条件下，4-HNE在血浆中的浓度极低，而细胞中则较高，但其浓度可以响应OS而增加100倍[9]。4-HNE可以通过修饰蛋白质的组氨酸、半胱氨酸和赖氨酸残基，形成HNE-蛋白质加合物参与细胞周期停滞，细胞分化和细胞死亡的调节[10]。既往文献报道，4-HNE的积累多与年龄相关性疾病相关，包括阿尔茨海默病、帕金森病、癌症等[11-13]。有研究显示，AMD患者血浆及视网膜中4-HNE水平均显著增高[14]。Sharma等[15]研究发现，4-HNE可以诱导RPE细胞中p53激活、磷酸化及核累积。因此本研究选择4-HNE作为诱导剂以模拟hRMEC的OS状态。
ER是细胞内合成蛋白质部位，负责蛋白质的折叠，生物合成，转运和翻译后修饰等过程。ER作为一个动态的细胞器，调控着几乎所有膜蛋白和大多数分泌蛋白的折叠和翻译后成熟。ER合成的蛋白质，需要通过蛋白质二硫键异构酶（PDI）家族和其他氧化还原酶介导形成二硫键才能获得特定的三维结构来发挥功能，并且ER中ROS的产生和消耗也有PDI的参与[16]。PDI对于维持ER稳态具有重要作用。研究发现，ER稳态一旦遭到破坏就会引起不正确蛋白质折叠，最终导致ER应激。而PDI在应激条件下可以防止蛋白质的蓄积，并且在珠蛋白的核心区维持疏水囊，从而抑制未折叠的蛋白效应（UPR）[17]。在生理条件下，免疫球蛋白重链结合蛋白/GRP78是正常细胞ER未折叠蛋白反应的主要调控因子[18]，而在应激条件下，GRP78在细胞膜上的过度表达介导大量蛋白质紊乱，促进细胞损伤凋亡。当ER稳态一旦受到破坏时，ER内的未折叠蛋白大量增加并聚集在ER上，引发UPR，进而激发内质网PERK/eIF2α/ATF4信号级联[19]，促进细胞凋亡，并且，作为ER应激诱导细胞凋亡的主要促凋亡基因，诱导的UPR调节CHOP在ER应激反应中也发挥着重要作用[20]。
PSF是细胞核内重要的调节蛋白，在修复DNA损伤，调节RNA转录等方面发挥重要作用[5]。在本研究中，我们发现4-HNE诱导细胞内Ero-1α/PDI降低，使得大量的未折叠的蛋白质聚集在ER上，大量未折叠蛋白质聚集引起GRP78表达增加，引发UPR。此外，我们发现4-HNE作用下ER PERK/eIF2α/ATF4信号通路也被激活，进一步导致UPR。UPR一方面导致ER氧化还原紊乱和ER应激反应，引起ER功能障碍进而导致细胞受损凋亡；另一方面UPR诱导CHOP表达引起细胞凋亡。而当PSF作用于受4-HNE诱导的hRMEC时，GRP78和CHOP表达下降，Ero-1/PDI表达增加。此外，我们观察到PERK，eIF的磷酸化及ATF4蛋白表达受到PSF抑制，从而导致PERK/eIF2a/ATF4信号通路激活受阻，提示PSF蛋白对OS状态下ER的保护作用。
本研究旨在以ER为切入点解读PSF对hRMEC OS的调控作用，并明确PSF作为潜在抗氧化剂其发挥作用的分子机制，为眼内OS相关性疾病的治疗提供新的可能靶点，目前我们的研究仅在细胞中进行了验证，PSF在体内的安全性及有效性尚需进一步明确。接下来我们将开展体内实验探究PSF的安全性及有效性，旨在全面掌握PSF对于眼内OS相关性疾病治疗的重要性。
