引用本文： 王振华, 郭小奇, 陈利军, 张如楠, 杨留勤, 武莉萍, 谷晓华. 苦参碱对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖、凋亡及放射敏感性的影响. 中华眼底病杂志, 2023, 39(10): 828-835. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20230907-00377 复制
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葡萄膜黑色素瘤是成人常见眼部原发性恶性肿瘤，起病隐匿且极易发生肝脏转移而导致预后不良[1-3]。早期可通过手术治疗，晚期通常采用靶向和免疫治疗，但均存在一定局限性，如长期用药导致患者出现耐药性、增加剂量导致不良反应过大、辅助药物毒副作用较大等[4]。苦参碱是传统中药苦参的重要药理活性成分，具有抗菌消炎、调节免疫、抗病毒、抗肿瘤等作用[5]；既往研究发现其可通过抑制癌细胞增殖，细胞周期阻滞，诱导凋亡以及逆转耐药等机制发挥抗肿瘤作用，在肝癌、乳腺癌、宫颈癌、胃癌中发挥重要作用[6-8]。此外，苦参碱可阻滞视网膜母细胞瘤（RB）停留在G0/G1期，诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖活性[9]。Zhao等[10]研究表明苦参碱降低RB对长春新碱的耐药性，抑制细胞增殖。为此，本研究探讨苦参碱对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖、凋亡以及放射敏感性的影响，以期为临床后续研究抗癌辅助药物提供新的依据。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要材料
人脉络膜黑色素瘤MuM2B细胞株（中国科学院细胞研究所）；BALB/C小鼠（湖北贝恩特生物科技有限公司）；苦参碱纯品（北京康纳瑞生物科技有限公司）；RPMI培养基、10%胎牛血清（美国Hyclone公司）；青链霉素混合液（北京索莱宝生物科技有限公司）；噻唑蓝（MTT）试剂盒（天津阿尔法生物科技有限公司）；凋亡试剂盒（南京凯基生物科技有限公司）；细胞周期蛋白D（CyclinD）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗（美国CST公司）。
1.2 体外实验
细胞培养与分组。MuM2B细胞株常规复苏，置于含10%胎牛血清、100 U/ml青链霉素的RPMI培养基中培养，每2天更换一次培养液，0.25%胰酶消化液进行消化传代，取第3代生长良好的对数生长期细胞，以浓度1×106个/ml、100 μl/孔接种于96孔板中，孵育24 h后分别加入浓度0.25、0.50、1.00、2.00 g/L的苦参碱，据此浓度分为4组，每组均设5个复孔；另设置5孔不加苦参碱作为对照组，其余培养条件与其他4组一致。
透射电子显微镜观察细胞形态。MuM2B细胞加入苦参碱后继续培养48 h，以离心半径8 cm、3 000 r/min离心10 min，收集细胞，4℃、2.5%戊二醛固定2 h，磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗3次，1%锇酸室温固定2 h，PBS漂洗3次。常规脱水漂洗、渗透、包埋、超薄切片后2%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，透射电子显微镜下观察拍照。
MTT比色法检测细胞增殖和细胞X射线照射敏感性，即放射敏感性。细胞增殖：MuM2B细胞加入苦参碱分别培养24、48、72、96 h后，每孔加入MTT溶液20 μl，继续培养4 h，二甲亚砜（DMSO）振荡10 min，酶标仪测量各孔样本在波长490 nm处的吸光度[A，旧称光密度（OD）]值，计算细胞存活率。细胞放射敏感性：MuM2B细胞接种于6孔板中，细胞贴壁后，分别给予0、2、4、6、8、10 Gy单次吸收剂量照射，每个剂量设置5个平行。照射条件为6 mV X射线，剂量率为300 cGy/min，源皮距100 cm。照射结束后封闭24 h，常规RPMI培养基培养，计算细胞存活率。细胞存活率（%）=各浓度组A值/对照A值×100%。
流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡率。MuM2B细胞加入苦参碱后继续培养48 h，0.25%胰蛋白酶消化，PBS漂洗2次，以离心半径8 cm、3 000 r/min离心10 min沉淀细胞，预冷PBS重悬细胞，加入1 ml体积分数为70%的乙醇，吹打混匀，4℃固定12 h，离心，PBS漂洗2次，重悬细胞。细胞周期：加入碘化丙啶（PI）0.5 ml，37℃避光孵育30 min；细胞凋亡率：分别加入5 μl膜联蛋白（Annexin）Ⅴ-异硫氰酸荧光素5 μl PI，避光染色10 min。流式细胞仪分别检测细胞周期、细胞凋亡率；Modfit软件分析各细胞周期的细胞百分比。
实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测细胞内CyclinD、Bcl-2、Bax mRNA相对表达量。收集各组细胞，Trizol法提取总RNA，逆转录合成cDNA。以cDNA为模板，使用SYBR Green Super Mix试剂盒进行聚合酶链反应扩增。所用引物由广州锐博生物科技有限公司合成（表1）。反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，40个循环。以GAPDH为内参照，2-△△CT法计算目的基因mRNA相对表达量。
表1
基因扩增和测序序列
蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测细胞内CyclinD、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量。收集各组细胞，PBS洗涤，4 ℃，以离心半径10 cm、14 000 r/min离心10 min，加入细胞/组织裂解液提取总蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法蛋白定量，取50 μg蛋白样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中上样电泳，转至聚偏氟乙烯膜上，5%牛血清白蛋白封闭2 h，洗膜后与特定一抗4℃孵育过夜。洗膜后加入二抗，37 ℃孵育2 h，洗膜，化学发光试剂盒显色，以GAPDH为内参照，凝胶成像系统扫描分析蛋白条带，计算目的蛋白相对表达量。
1.3 体内实验
BALB/C小鼠50只，鼠龄5～6周龄，体重15～17 g，湖北贝恩特生物科技有限公司提供[生产许可证号：SCXK（鄂）2021-0027]。本研究通过新乡市中心医院动物伦理委员审核（批准号：XXZX-KY-2020037）。
脉络膜黑色素瘤移植瘤小鼠模型建立与分组。MuM2B细胞制成密度为5×106个/ml的细胞悬液，于小鼠前肢背部皮下注射100 μl，注射后7 d注射部位触及小肿块为建模成功。建模后小鼠随机分为空白组以及苦参碱15、25、50、100 mg/kg组，每组均为10只小鼠。参照文献[11]的方法，空白组小鼠瘤周皮下注射PBS；不同剂量苦参碱处理组小鼠瘤周皮下分别注射15、25、50、100 mg/kg苦参碱，1次/d，连续7 d。末次给药2 h后，处死所有小鼠并剥离瘤体，称取瘤体重量并测量其体积。
苏木精-伊红（HE）染色观察小鼠肿瘤细胞形态变化。肿瘤组织置于含4%多聚甲醛中固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，制作4 μm厚度的连续切片。HE染色，光学显微镜下观察拍照。
1.4 统计学方法
采用SPSS22.0软件行统计学分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析；组间两两比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 苦参碱使MuM2B细胞呈凋亡形态改变
透射电子显微镜观察发现，对照组细胞结构正常，分布均匀，胞核、核仁较大，核仁不规则，细胞多为多边形、圆形、梭形等；未见或少见核固缩。不同浓度苦参碱组随浓度升高细胞核固缩逐渐增多，出现小片状无细胞生长区，包浆浓缩，细胞形态明显变化，胞质内出现较多大小不等的空泡（图1）。
图1
对照组、不同浓度苦参碱组细胞透射电子显微镜像（标尺：100 μm）
1A示对照组，可见核仁较大，边界清晰，核染色质丰富；1B～1E分别示苦参碱0.25、0.50、1.00、2.00 g/L组，核仁变小，核浓缩，核染色质聚集，逐步分裂为碎片，形成凋亡小体
2.2 苦参碱降低MuM2B细胞增殖活性
MTT法检测结果显示，对照组、不同浓度苦参碱组不同作用时间（24、48、72、96 h）细胞存活率总体比较，差异有统计学意义（F=46.946、90.872、135.330、201.698，P=0.000）。其中，对照组与苦参碱0.25 g/L组不同作用时间（24、48、72、96 h）细胞存活率比较，差异均无统计学意义（t=0.365、0.205、0.299、0.202，P＞0.05）；与对照组比较，苦参碱0.50、1.00、2.00 g/L组细胞存活率随苦参碱浓度升高及作用时间延长，细胞存活率逐渐降低，差异均有统计学意义（24 h：t=6.349、9.497、14.336；48 h：t=11.398、14.750、17.268；72 h：t=12.979、16.705、19.890；96 h：t=17.238、20.748、26.642；P＜0.05）（图2）。
图2
苦参碱不同浓度和作用时间对MuM2B细胞增殖的影响（n=3）
a同一作用时间，与对照组比较，
2.3 苦参碱阻滞MuM2B细胞周期并诱导细胞凋亡
流式细胞仪检测结果显示，对照组、不同浓度苦参碱组细胞周期总体比例比较，差异有统计学意义（F=54.833、35.823、25.011，P=0.000）。其中，与对照组比较，苦参碱0.25 g/L组细胞G0/G1期、G2/M期、S期细胞比例无显著变化，差异无统计学意义（t=2.451、1.855、1.456，P＞0.05）；与对照组比较，苦参碱0.50、1.00、2.00 g/L组随苦参碱浓度升高，G0/G1期细胞比例显著升高（t=8.355、10.998、13.158，P＜0.05），G2/M期、S期细胞比例降低，差异均有统计学意义（G2/M期：t=4.732、7.088、8.768；S期：t=4.499、6.407、8.223；P＜0.05）（图3）。
图3
对照组与不同浓度苦参碱组细胞周期比例（n=3） a与对照组比较，P＜0.05；b与苦参碱0.25 g/L组比较，P＜0.05；c与苦参碱0.5 g/L组比较，P＜0.05；d与苦参碱1.00 g/L组比较，P＜0.05
对照组、不同浓度苦参碱组细胞凋亡率总体比较，差异有统计学意义（F=155.710，P=0.001）。其中，与对照组比较，苦参碱0.25、0.50、1.00、2.00 g/L组均随苦参碱浓度升高，细胞凋亡率显著升高，差异有统计学意义（t=5.140、14.215、16.145、22.094，P＜0.05）（图4）。
图4
对照组与不同浓度苦参碱组细胞凋亡率比较（n=3）
a与对照组比较，
2.4 苦参碱可提高MuM2B细胞对放射线的敏感性
MTT法检测结果显示，同一照射剂量下，对照组、不同浓度苦参碱组细胞存活率总体比较，差异有统计学意义（F=47.071，P=0.000）。其中，与对照组比较，苦参碱0.25g/L组细胞存活率无显著变化，差异无统计学意义（t=1.633，P＞0.05）；苦参碱0.50、1.00、2.00 g/L组随苦参碱浓度升高细胞存活率显著降低，差异有统计学意义（t=5.284、6.928、13.451，P＜0.05）（图5）。
图5
苦参碱对不同吸收剂量X线照射下MuM2B细胞存活率的影响（n=3）
2.5 苦参碱抑制MuM2B细胞增殖、凋亡相关基因表达
qRT-PCR检测结果显示，对照组、不同浓度苦参碱组细胞内CyclinD、Bcl-2、Bax mRNA相对表达量总体比较，差异有统计学意义（F=50.795、80.265、718.138，P=0.000）。其中，与对照组比较，苦参碱0.25 g/L组细胞中CyclinD、Bcl-2、Bax mRNA相对表达量无显著变化，差异无统计学意义（t=2.118、1.837、3.008，P＞0.05）；与对照组比较，苦参碱0.50、1.00、2.00 g/L组随苦参碱浓度升高，细胞中CyclinD（t=5.205、9.180、12.668）、Bcl-2（t=4.885、12.010、16.573）mRNA相对表达量逐渐降低，Bax（t=13.692、26.594、38.127） mRNA相对表达量逐渐升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）（图6）。
图6
不同浓度苦参碱刺激浓度对细胞内CyclinD、Bcl-2、Bax mRNA表达的影响（n=3） CyclinD：细胞周期蛋白D；Bcl-2：B淋巴细胞瘤-2；Bax：Bcl-2相关X蛋白；a与对照组比较，P＜0.05；b与苦参碱0.25 g/L组比较，P＜0.05；c与苦参碱0.5 g/L组比较，P＜0.05；d与苦参碱1.00 g/L组比较，P＜0.05
2.6 苦参碱抑制MuM2B细胞增殖、凋亡相关蛋白表达
Western blot检测结果显示，对照组、不同浓度苦参碱组细胞内CyclinD、Bcl-2、Bax 蛋白相对表达量总体比较，差异有统计学意义（F=20.945、35.116、34.067，P=0.000）。其中，与对照组比较，苦参碱0.25 g/L组细胞中CyclinD、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量无显著变化，差异无统计学意义（t=0.490、0.680、1.386，P＞0.05）；与对照组比较，苦参碱0.50、1.00、2.00 g/L随苦参碱浓度升高，细胞中CyclinD（t=2.976、5.495、7.746）、Bcl-2（t=4.254、6.725、10.376）蛋白相对表达量逐渐降低，Bax（t=5.347、7.733、9.122）蛋白相对表达量逐渐升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）（图7）。
图7
不同浓度苦参碱对MuM2B细胞增殖、凋亡相关蛋白表达的影响（n=3）
7A示电泳图，A～E分别示对照组及苦参碱0.25、0.50、1.00、2.00 g/L组；7B示5组细胞内 CyclinD、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量比较 CyclinD：细胞周期蛋白D；Bcl-2：B淋巴细胞瘤-2；Bax：Bcl-2相关X蛋白；GAPDH：磷酸甘油醛脱氢酶；a与对照组比较，
2.7 苦参碱抑制葡萄膜黑色素瘤体内生长
干预后，空白组及苦参碱15、25、50、100 mg/kg组小鼠肿瘤重量分别为（0.57±0.03）、（0.50±0.03）、（0.43±0.02）、（0.37±0.02）、（0.31±0.02）g；5组小鼠肿瘤重量总体比较，差异有统计学意义（F=176.333，P=0.000）。其中，与空白组比较，不同剂量苦参碱组小鼠肿瘤重量显著降低，差异有统计学意义（t=5.217、12.279、17.541、22.804，P＜0.05）（图8A，8B）。
图8
不同浓度苦参碱对肿瘤的影响（n=10）
8A示空白组及苦参碱15、25、50、100 mg/kg组小鼠肿瘤大体标本；8B示5组小鼠肿瘤体量比较；8C示5组小鼠干预前后肿瘤体积比较 a与空白组比较，
干预前，空白组及苦参碱15、25、50、100 mg/kg组小鼠肿瘤体积分别为（71.84±3.49）、（72.85±3.40）、（71.22±3.28）、（70.62±3.06）、（70.41±3.40）mm3；5组小鼠肿瘤体积总体比较，差异无统计学意义（F=0.883，P＞0.05）。干预后，空白组及不同剂量苦参碱组小鼠肿瘤体积分别为（141.22±12.54）、（124.54±13.67）、（108.83±11.22）、（81.48±8.10）、（77.05±7.59）mm3；5组小鼠肿瘤体积比较，差异有统计学意义（F=63.837，P＜0.05）。其中，与空白组比较，不同剂量苦参碱组小鼠肿瘤体积显著缩小，差异有统计学意义（t=2.843、6.087、12.655、13.844，P＜0.05）（图8C）。
光学显微镜观察发现，空白组肿瘤细胞弥漫分布，呈圆形、椭圆形或不规则形状，排列紊乱紧密，细胞核染色加深，核浆比增大，核分裂相多见；不同浓度苦参碱组肿瘤细胞数量减少，细胞界限模糊，核固缩，分裂象减少，出现大片坏死（图9）。
图9
空白组及不同剂量苦参碱组肿瘤组织光学显微镜像（苏木精-伊红染色，标尺：50 μm）
9A示空白组，细胞排列紊乱紧密，形态不规则，细胞核深染；9B～9E分别苦参碱15、25、50、100 mg/kg组，细胞数量减少，核固缩，可见大片坏死
3 讨论
葡萄膜黑色素瘤是一种死亡率极高的恶性肿瘤，细胞恶性增殖、侵袭是导致疾病难以根治以及患者预后较差的根本原因[12]。目前其治疗方式主要为放射治疗，但由于葡萄膜黑色素瘤细胞增殖与侵袭能力较强，导致治疗效果较差，影响患者生存质量。研究发现，癌细胞中多种生长因子均会对细胞放射线敏感性造成影响，如细胞增殖因子、凋亡因子等，最终导致患者死亡率高、生存率低以及预后差[13-14]。
中药具有安全性高、价格低廉以及副作用低等特点，可通过多种途径抑制肿瘤细胞增殖、转移，降低肿瘤发生率[15]。有研究发现，木犀草素可抑制葡萄膜黑色素瘤中血管生成，发挥抗葡萄膜黑色素瘤作用[16]；小白菊内酯可抑制葡萄膜黑色素瘤细胞增殖，诱导凋亡[17]。石蒜碱可引起葡萄膜黑色素瘤细胞S期阻滞，诱导细胞凋亡，从而发挥抗癌作用[18]。苦参碱作为一种临床应用价值较高的中药活性成分，在抗肿瘤中发挥着重要作用，能够通过抵抗细胞周期进展，抑制细胞增殖以及诱导细胞凋亡等过程抑制肿瘤发生与发展，还可与其他放射治疗（放疗）、化学药物治疗（化疗）药物联合使用，协同发挥抗肿瘤作用以及提高肿瘤细胞的放疗敏感性，以发挥更好的治疗效果[19-21]。前期研究表明，苦参碱在眼底疾病中具有一定作用，通过抑制血管内皮细胞增殖，改善糖尿病视网膜病理损伤[22]。
细胞持续不断的分裂与增殖是肿瘤细胞进展迅速的重要原因之一，因此抑制细胞增殖，并诱导细胞凋亡是临床治疗恶性肿瘤的主要目的之一[23]。细胞凋亡是指程序性细胞丝死亡Bcl家族蛋白是常见的凋亡蛋白之一，其中Bcl-2是抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白，当Bcl-2水平降低，Bax水平升高，细胞趋向凋亡[24]。CyclinD主要见于一些原发性恶性肿瘤，并在癌细胞中高表达，调节细胞周期，促进细胞增殖，临床上常用于肿瘤早期诊断与预后诊断[25]。本研究结果显示，不同浓度苦参碱处理后，MuM2B细胞形态改变，出现大量核固缩，存活率降低，凋亡率升高，G0/G1期细胞比例升高，G2/M期、S期细胞比例降低，CyclinD、Bcl-2表达显著降低，Bax水平升高，表明苦参碱可通过下调CyclinD、Bcl-2表达，增加Bax表达，降低MuM2B细胞的存活率，提高凋亡率，且具有剂量效应，提示苦参碱具有抑制MuM2B细胞增殖、阻滞细胞周期进展并诱导凋亡的作用。本研究结果与史雪丽等[26]报道的马钱子碱通过改变线粒体凋亡途径中凋亡相关信号分子Bax及Bcl-2的表达，抑制黑色素瘤细胞增殖并促进细胞凋亡的结论具有一致性。
常规放疗主要是通过促进肿瘤细胞重新氧合、细胞周期重新分布过程实现的，但在放疗过程中部分肿瘤细胞会产生一定的放疗抵抗性并进一步克隆增生更多的放疗耐受细胞[27-28]。本研究结果显示，不同浓度苦参碱处理后，细胞存活率降低，表明苦参碱处理后，MuM2B细胞对放疗的敏感性增加，且具有剂量效应，提示苦参碱可有效增强MuM2B细胞的放疗敏感性。另外，本研究体内实验结果显示，苦参碱可显著抑制肿瘤生长，这与Zhang等[29]研究结果一致，表明苦参碱可抑制葡萄膜黑色素瘤生长。
本研究通过设置不同浓度的苦参碱处理MuM2B细胞，探讨其对MuM2B细胞增殖、凋亡和放疗敏感性的影响，发现苦参碱能够有效抑制MuM2B细胞增殖、阻滞细胞周期并诱导其发生凋亡，增强其放疗敏感性，为今后开发葡萄膜黑色素瘤新的治疗药物和放化疗辅助药物提供了新思路。
本研究存在的不足是苦参碱发挥抗葡萄膜黑色素瘤的主要成分和具体机制仍需进行深入研究；细胞增殖、凋亡机制复杂，涉及多条信号通路，本研究对细胞增殖、凋亡等相关蛋白表达的研究过于单一，今后研究尚需要进一步补充和完善。
葡萄膜黑色素瘤是成人常见眼部原发性恶性肿瘤，起病隐匿且极易发生肝脏转移而导致预后不良[1-3]。早期可通过手术治疗，晚期通常采用靶向和免疫治疗，但均存在一定局限性，如长期用药导致患者出现耐药性、增加剂量导致不良反应过大、辅助药物毒副作用较大等[4]。苦参碱是传统中药苦参的重要药理活性成分，具有抗菌消炎、调节免疫、抗病毒、抗肿瘤等作用[5]；既往研究发现其可通过抑制癌细胞增殖，细胞周期阻滞，诱导凋亡以及逆转耐药等机制发挥抗肿瘤作用，在肝癌、乳腺癌、宫颈癌、胃癌中发挥重要作用[6-8]。此外，苦参碱可阻滞视网膜母细胞瘤（RB）停留在G0/G1期，诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖活性[9]。Zhao等[10]研究表明苦参碱降低RB对长春新碱的耐药性，抑制细胞增殖。为此，本研究探讨苦参碱对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖、凋亡以及放射敏感性的影响，以期为临床后续研究抗癌辅助药物提供新的依据。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要材料
人脉络膜黑色素瘤MuM2B细胞株（中国科学院细胞研究所）；BALB/C小鼠（湖北贝恩特生物科技有限公司）；苦参碱纯品（北京康纳瑞生物科技有限公司）；RPMI培养基、10%胎牛血清（美国Hyclone公司）；青链霉素混合液（北京索莱宝生物科技有限公司）；噻唑蓝（MTT）试剂盒（天津阿尔法生物科技有限公司）；凋亡试剂盒（南京凯基生物科技有限公司）；细胞周期蛋白D（CyclinD）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗（美国CST公司）。
1.2 体外实验
细胞培养与分组。MuM2B细胞株常规复苏，置于含10%胎牛血清、100 U/ml青链霉素的RPMI培养基中培养，每2天更换一次培养液，0.25%胰酶消化液进行消化传代，取第3代生长良好的对数生长期细胞，以浓度1×106个/ml、100 μl/孔接种于96孔板中，孵育24 h后分别加入浓度0.25、0.50、1.00、2.00 g/L的苦参碱，据此浓度分为4组，每组均设5个复孔；另设置5孔不加苦参碱作为对照组，其余培养条件与其他4组一致。
透射电子显微镜观察细胞形态。MuM2B细胞加入苦参碱后继续培养48 h，以离心半径8 cm、3 000 r/min离心10 min，收集细胞，4℃、2.5%戊二醛固定2 h，磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗3次，1%锇酸室温固定2 h，PBS漂洗3次。常规脱水漂洗、渗透、包埋、超薄切片后2%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，透射电子显微镜下观察拍照。
MTT比色法检测细胞增殖和细胞X射线照射敏感性，即放射敏感性。细胞增殖：MuM2B细胞加入苦参碱分别培养24、48、72、96 h后，每孔加入MTT溶液20 μl，继续培养4 h，二甲亚砜（DMSO）振荡10 min，酶标仪测量各孔样本在波长490 nm处的吸光度[A，旧称光密度（OD）]值，计算细胞存活率。细胞放射敏感性：MuM2B细胞接种于6孔板中，细胞贴壁后，分别给予0、2、4、6、8、10 Gy单次吸收剂量照射，每个剂量设置5个平行。照射条件为6 mV X射线，剂量率为300 cGy/min，源皮距100 cm。照射结束后封闭24 h，常规RPMI培养基培养，计算细胞存活率。细胞存活率（%）=各浓度组A值/对照A值×100%。
流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡率。MuM2B细胞加入苦参碱后继续培养48 h，0.25%胰蛋白酶消化，PBS漂洗2次，以离心半径8 cm、3 000 r/min离心10 min沉淀细胞，预冷PBS重悬细胞，加入1 ml体积分数为70%的乙醇，吹打混匀，4℃固定12 h，离心，PBS漂洗2次，重悬细胞。细胞周期：加入碘化丙啶（PI）0.5 ml，37℃避光孵育30 min；细胞凋亡率：分别加入5 μl膜联蛋白（Annexin）Ⅴ-异硫氰酸荧光素5 μl PI，避光染色10 min。流式细胞仪分别检测细胞周期、细胞凋亡率；Modfit软件分析各细胞周期的细胞百分比。
实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测细胞内CyclinD、Bcl-2、Bax mRNA相对表达量。收集各组细胞，Trizol法提取总RNA，逆转录合成cDNA。以cDNA为模板，使用SYBR Green Super Mix试剂盒进行聚合酶链反应扩增。所用引物由广州锐博生物科技有限公司合成（表1）。反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，40个循环。以GAPDH为内参照，2-△△CT法计算目的基因mRNA相对表达量。
表1
基因扩增和测序序列
蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测细胞内CyclinD、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量。收集各组细胞，PBS洗涤，4 ℃，以离心半径10 cm、14 000 r/min离心10 min，加入细胞/组织裂解液提取总蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法蛋白定量，取50 μg蛋白样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中上样电泳，转至聚偏氟乙烯膜上，5%牛血清白蛋白封闭2 h，洗膜后与特定一抗4℃孵育过夜。洗膜后加入二抗，37 ℃孵育2 h，洗膜，化学发光试剂盒显色，以GAPDH为内参照，凝胶成像系统扫描分析蛋白条带，计算目的蛋白相对表达量。
1.3 体内实验
BALB/C小鼠50只，鼠龄5～6周龄，体重15～17 g，湖北贝恩特生物科技有限公司提供[生产许可证号：SCXK（鄂）2021-0027]。本研究通过新乡市中心医院动物伦理委员审核（批准号：XXZX-KY-2020037）。
脉络膜黑色素瘤移植瘤小鼠模型建立与分组。MuM2B细胞制成密度为5×106个/ml的细胞悬液，于小鼠前肢背部皮下注射100 μl，注射后7 d注射部位触及小肿块为建模成功。建模后小鼠随机分为空白组以及苦参碱15、25、50、100 mg/kg组，每组均为10只小鼠。参照文献[11]的方法，空白组小鼠瘤周皮下注射PBS；不同剂量苦参碱处理组小鼠瘤周皮下分别注射15、25、50、100 mg/kg苦参碱，1次/d，连续7 d。末次给药2 h后，处死所有小鼠并剥离瘤体，称取瘤体重量并测量其体积。
苏木精-伊红（HE）染色观察小鼠肿瘤细胞形态变化。肿瘤组织置于含4%多聚甲醛中固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，制作4 μm厚度的连续切片。HE染色，光学显微镜下观察拍照。
1.4 统计学方法
采用SPSS22.0软件行统计学分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析；组间两两比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 苦参碱使MuM2B细胞呈凋亡形态改变
透射电子显微镜观察发现，对照组细胞结构正常，分布均匀，胞核、核仁较大，核仁不规则，细胞多为多边形、圆形、梭形等；未见或少见核固缩。不同浓度苦参碱组随浓度升高细胞核固缩逐渐增多，出现小片状无细胞生长区，包浆浓缩，细胞形态明显变化，胞质内出现较多大小不等的空泡（图1）。
图1
对照组、不同浓度苦参碱组细胞透射电子显微镜像（标尺：100 μm）
1A示对照组，可见核仁较大，边界清晰，核染色质丰富；1B～1E分别示苦参碱0.25、0.50、1.00、2.00 g/L组，核仁变小，核浓缩，核染色质聚集，逐步分裂为碎片，形成凋亡小体
2.2 苦参碱降低MuM2B细胞增殖活性
MTT法检测结果显示，对照组、不同浓度苦参碱组不同作用时间（24、48、72、96 h）细胞存活率总体比较，差异有统计学意义（F=46.946、90.872、135.330、201.698，P=0.000）。其中，对照组与苦参碱0.25 g/L组不同作用时间（24、48、72、96 h）细胞存活率比较，差异均无统计学意义（t=0.365、0.205、0.299、0.202，P＞0.05）；与对照组比较，苦参碱0.50、1.00、2.00 g/L组细胞存活率随苦参碱浓度升高及作用时间延长，细胞存活率逐渐降低，差异均有统计学意义（24 h：t=6.349、9.497、14.336；48 h：t=11.398、14.750、17.268；72 h：t=12.979、16.705、19.890；96 h：t=17.238、20.748、26.642；P＜0.05）（图2）。
图2
苦参碱不同浓度和作用时间对MuM2B细胞增殖的影响（n=3）
a同一作用时间，与对照组比较，
2.3 苦参碱阻滞MuM2B细胞周期并诱导细胞凋亡
流式细胞仪检测结果显示，对照组、不同浓度苦参碱组细胞周期总体比例比较，差异有统计学意义（F=54.833、35.823、25.011，P=0.000）。其中，与对照组比较，苦参碱0.25 g/L组细胞G0/G1期、G2/M期、S期细胞比例无显著变化，差异无统计学意义（t=2.451、1.855、1.456，P＞0.05）；与对照组比较，苦参碱0.50、1.00、2.00 g/L组随苦参碱浓度升高，G0/G1期细胞比例显著升高（t=8.355、10.998、13.158，P＜0.05），G2/M期、S期细胞比例降低，差异均有统计学意义（G2/M期：t=4.732、7.088、8.768；S期：t=4.499、6.407、8.223；P＜0.05）（图3）。
图3
对照组与不同浓度苦参碱组细胞周期比例（n=3） a与对照组比较，P＜0.05；b与苦参碱0.25 g/L组比较，P＜0.05；c与苦参碱0.5 g/L组比较，P＜0.05；d与苦参碱1.00 g/L组比较，P＜0.05
对照组、不同浓度苦参碱组细胞凋亡率总体比较，差异有统计学意义（F=155.710，P=0.001）。其中，与对照组比较，苦参碱0.25、0.50、1.00、2.00 g/L组均随苦参碱浓度升高，细胞凋亡率显著升高，差异有统计学意义（t=5.140、14.215、16.145、22.094，P＜0.05）（图4）。
图4
对照组与不同浓度苦参碱组细胞凋亡率比较（n=3）
a与对照组比较，
2.4 苦参碱可提高MuM2B细胞对放射线的敏感性
MTT法检测结果显示，同一照射剂量下，对照组、不同浓度苦参碱组细胞存活率总体比较，差异有统计学意义（F=47.071，P=0.000）。其中，与对照组比较，苦参碱0.25g/L组细胞存活率无显著变化，差异无统计学意义（t=1.633，P＞0.05）；苦参碱0.50、1.00、2.00 g/L组随苦参碱浓度升高细胞存活率显著降低，差异有统计学意义（t=5.284、6.928、13.451，P＜0.05）（图5）。
图5
苦参碱对不同吸收剂量X线照射下MuM2B细胞存活率的影响（n=3）
2.5 苦参碱抑制MuM2B细胞增殖、凋亡相关基因表达
qRT-PCR检测结果显示，对照组、不同浓度苦参碱组细胞内CyclinD、Bcl-2、Bax mRNA相对表达量总体比较，差异有统计学意义（F=50.795、80.265、718.138，P=0.000）。其中，与对照组比较，苦参碱0.25 g/L组细胞中CyclinD、Bcl-2、Bax mRNA相对表达量无显著变化，差异无统计学意义（t=2.118、1.837、3.008，P＞0.05）；与对照组比较，苦参碱0.50、1.00、2.00 g/L组随苦参碱浓度升高，细胞中CyclinD（t=5.205、9.180、12.668）、Bcl-2（t=4.885、12.010、16.573）mRNA相对表达量逐渐降低，Bax（t=13.692、26.594、38.127） mRNA相对表达量逐渐升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）（图6）。
图6
不同浓度苦参碱刺激浓度对细胞内CyclinD、Bcl-2、Bax mRNA表达的影响（n=3） CyclinD：细胞周期蛋白D；Bcl-2：B淋巴细胞瘤-2；Bax：Bcl-2相关X蛋白；a与对照组比较，P＜0.05；b与苦参碱0.25 g/L组比较，P＜0.05；c与苦参碱0.5 g/L组比较，P＜0.05；d与苦参碱1.00 g/L组比较，P＜0.05
2.6 苦参碱抑制MuM2B细胞增殖、凋亡相关蛋白表达
Western blot检测结果显示，对照组、不同浓度苦参碱组细胞内CyclinD、Bcl-2、Bax 蛋白相对表达量总体比较，差异有统计学意义（F=20.945、35.116、34.067，P=0.000）。其中，与对照组比较，苦参碱0.25 g/L组细胞中CyclinD、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量无显著变化，差异无统计学意义（t=0.490、0.680、1.386，P＞0.05）；与对照组比较，苦参碱0.50、1.00、2.00 g/L随苦参碱浓度升高，细胞中CyclinD（t=2.976、5.495、7.746）、Bcl-2（t=4.254、6.725、10.376）蛋白相对表达量逐渐降低，Bax（t=5.347、7.733、9.122）蛋白相对表达量逐渐升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）（图7）。
图7
不同浓度苦参碱对MuM2B细胞增殖、凋亡相关蛋白表达的影响（n=3）
7A示电泳图，A～E分别示对照组及苦参碱0.25、0.50、1.00、2.00 g/L组；7B示5组细胞内 CyclinD、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量比较 CyclinD：细胞周期蛋白D；Bcl-2：B淋巴细胞瘤-2；Bax：Bcl-2相关X蛋白；GAPDH：磷酸甘油醛脱氢酶；a与对照组比较，
2.7 苦参碱抑制葡萄膜黑色素瘤体内生长
干预后，空白组及苦参碱15、25、50、100 mg/kg组小鼠肿瘤重量分别为（0.57±0.03）、（0.50±0.03）、（0.43±0.02）、（0.37±0.02）、（0.31±0.02）g；5组小鼠肿瘤重量总体比较，差异有统计学意义（F=176.333，P=0.000）。其中，与空白组比较，不同剂量苦参碱组小鼠肿瘤重量显著降低，差异有统计学意义（t=5.217、12.279、17.541、22.804，P＜0.05）（图8A，8B）。
图8
不同浓度苦参碱对肿瘤的影响（n=10）
8A示空白组及苦参碱15、25、50、100 mg/kg组小鼠肿瘤大体标本；8B示5组小鼠肿瘤体量比较；8C示5组小鼠干预前后肿瘤体积比较 a与空白组比较，
干预前，空白组及苦参碱15、25、50、100 mg/kg组小鼠肿瘤体积分别为（71.84±3.49）、（72.85±3.40）、（71.22±3.28）、（70.62±3.06）、（70.41±3.40）mm3；5组小鼠肿瘤体积总体比较，差异无统计学意义（F=0.883，P＞0.05）。干预后，空白组及不同剂量苦参碱组小鼠肿瘤体积分别为（141.22±12.54）、（124.54±13.67）、（108.83±11.22）、（81.48±8.10）、（77.05±7.59）mm3；5组小鼠肿瘤体积比较，差异有统计学意义（F=63.837，P＜0.05）。其中，与空白组比较，不同剂量苦参碱组小鼠肿瘤体积显著缩小，差异有统计学意义（t=2.843、6.087、12.655、13.844，P＜0.05）（图8C）。
光学显微镜观察发现，空白组肿瘤细胞弥漫分布，呈圆形、椭圆形或不规则形状，排列紊乱紧密，细胞核染色加深，核浆比增大，核分裂相多见；不同浓度苦参碱组肿瘤细胞数量减少，细胞界限模糊，核固缩，分裂象减少，出现大片坏死（图9）。
图9
空白组及不同剂量苦参碱组肿瘤组织光学显微镜像（苏木精-伊红染色，标尺：50 μm）
9A示空白组，细胞排列紊乱紧密，形态不规则，细胞核深染；9B～9E分别苦参碱15、25、50、100 mg/kg组，细胞数量减少，核固缩，可见大片坏死
3 讨论
葡萄膜黑色素瘤是一种死亡率极高的恶性肿瘤，细胞恶性增殖、侵袭是导致疾病难以根治以及患者预后较差的根本原因[12]。目前其治疗方式主要为放射治疗，但由于葡萄膜黑色素瘤细胞增殖与侵袭能力较强，导致治疗效果较差，影响患者生存质量。研究发现，癌细胞中多种生长因子均会对细胞放射线敏感性造成影响，如细胞增殖因子、凋亡因子等，最终导致患者死亡率高、生存率低以及预后差[13-14]。
中药具有安全性高、价格低廉以及副作用低等特点，可通过多种途径抑制肿瘤细胞增殖、转移，降低肿瘤发生率[15]。有研究发现，木犀草素可抑制葡萄膜黑色素瘤中血管生成，发挥抗葡萄膜黑色素瘤作用[16]；小白菊内酯可抑制葡萄膜黑色素瘤细胞增殖，诱导凋亡[17]。石蒜碱可引起葡萄膜黑色素瘤细胞S期阻滞，诱导细胞凋亡，从而发挥抗癌作用[18]。苦参碱作为一种临床应用价值较高的中药活性成分，在抗肿瘤中发挥着重要作用，能够通过抵抗细胞周期进展，抑制细胞增殖以及诱导细胞凋亡等过程抑制肿瘤发生与发展，还可与其他放射治疗（放疗）、化学药物治疗（化疗）药物联合使用，协同发挥抗肿瘤作用以及提高肿瘤细胞的放疗敏感性，以发挥更好的治疗效果[19-21]。前期研究表明，苦参碱在眼底疾病中具有一定作用，通过抑制血管内皮细胞增殖，改善糖尿病视网膜病理损伤[22]。
细胞持续不断的分裂与增殖是肿瘤细胞进展迅速的重要原因之一，因此抑制细胞增殖，并诱导细胞凋亡是临床治疗恶性肿瘤的主要目的之一[23]。细胞凋亡是指程序性细胞丝死亡Bcl家族蛋白是常见的凋亡蛋白之一，其中Bcl-2是抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白，当Bcl-2水平降低，Bax水平升高，细胞趋向凋亡[24]。CyclinD主要见于一些原发性恶性肿瘤，并在癌细胞中高表达，调节细胞周期，促进细胞增殖，临床上常用于肿瘤早期诊断与预后诊断[25]。本研究结果显示，不同浓度苦参碱处理后，MuM2B细胞形态改变，出现大量核固缩，存活率降低，凋亡率升高，G0/G1期细胞比例升高，G2/M期、S期细胞比例降低，CyclinD、Bcl-2表达显著降低，Bax水平升高，表明苦参碱可通过下调CyclinD、Bcl-2表达，增加Bax表达，降低MuM2B细胞的存活率，提高凋亡率，且具有剂量效应，提示苦参碱具有抑制MuM2B细胞增殖、阻滞细胞周期进展并诱导凋亡的作用。本研究结果与史雪丽等[26]报道的马钱子碱通过改变线粒体凋亡途径中凋亡相关信号分子Bax及Bcl-2的表达，抑制黑色素瘤细胞增殖并促进细胞凋亡的结论具有一致性。
常规放疗主要是通过促进肿瘤细胞重新氧合、细胞周期重新分布过程实现的，但在放疗过程中部分肿瘤细胞会产生一定的放疗抵抗性并进一步克隆增生更多的放疗耐受细胞[27-28]。本研究结果显示，不同浓度苦参碱处理后，细胞存活率降低，表明苦参碱处理后，MuM2B细胞对放疗的敏感性增加，且具有剂量效应，提示苦参碱可有效增强MuM2B细胞的放疗敏感性。另外，本研究体内实验结果显示，苦参碱可显著抑制肿瘤生长，这与Zhang等[29]研究结果一致，表明苦参碱可抑制葡萄膜黑色素瘤生长。
本研究通过设置不同浓度的苦参碱处理MuM2B细胞，探讨其对MuM2B细胞增殖、凋亡和放疗敏感性的影响，发现苦参碱能够有效抑制MuM2B细胞增殖、阻滞细胞周期并诱导其发生凋亡，增强其放疗敏感性，为今后开发葡萄膜黑色素瘤新的治疗药物和放化疗辅助药物提供了新思路。
本研究存在的不足是苦参碱发挥抗葡萄膜黑色素瘤的主要成分和具体机制仍需进行深入研究；细胞增殖、凋亡机制复杂，涉及多条信号通路，本研究对细胞增殖、凋亡等相关蛋白表达的研究过于单一，今后研究尚需要进一步补充和完善。
