沉默<i>RasGRP4</i>基因对糖尿病小鼠视网膜病变的治疗作用_《中华眼底病杂志》

作者：

李青博 ¹ , 周旭 ¹ , 周赛君 ² , 邵彦 ¹ , 李筱荣 ¹ ,  刘巨平 ¹

1. 天津医科大学眼科医院、眼视光学院、眼科研究所国家眼耳鼻喉疾病临床医学研究中心天津市分中心天津市视网膜功能与疾病重点实验室, 天津 300384;
2. 天津医科大学朱宪彝纪念医院天津市内分泌研究所国家卫健委激素与发育重点实验室天津市代谢性疾病重点实验室, 天津 300134;

关键词：

RasGRP4基因糖尿病视网膜病变炎症 NOD样受体热蛋白结构域蛋白3炎症小体

DOI：

10.3760/cma.j.cn511434-20240428-00175

视频：

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摘要 全文 图表 视频 参考文献 施引文献 补充材料

目的观察RasGRP4基因缺失对糖尿病小鼠视网膜结构和功能的影响，并探究RasGRP4基因在糖尿病视网膜病变（DR）中的作用机制。方法雄性C57BL/6J小鼠12只，分为正常组和糖尿病组（DM组），每组各6只；雄性RasGRP4基因敲除小鼠6只，为RasGRP4基因敲除糖尿病组（DM-KO组）。DM组和DM-KO组通过高脂饮食联合腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病小鼠模型，定期监测体重、血糖。建模后3个月采用光相干断层扫描检查检测各组小鼠视网膜厚度及神经节细胞层厚度；视网膜电图检测暗适应条件下小鼠视网膜总体功能。收集DM组、DM-KO组小鼠视网膜，提取总RNA，进行转录组测序筛选差异表达基因（DEG），应用Cytoscape v3.8.2软件的MCODE和Cytohubba插件筛选核心基因；同时对筛选得到的DEG进行基因样本（GO）功能富集分析。采用实时定量聚合酶链反应检测各组小鼠白细胞介素（IL）-8、转化生长因子-β（TGF-β）、干扰素-γ（IFN-γ）、NOD样受体热蛋白结构域蛋白3（NLRP3）、半胱天冬酶-1（Caspase-1）、IL-1β mRNA相对表达量。两组间比较采用t检验；三组间比较采用单因素方差分析。结果与DM组相比，DM-KO组小鼠随着高脂饮食时间延长，血糖、体重之间的差异无统计学意义（t=0.12、2.02、0.22、0.10、0.59、0.41、1.35、0.31、1.12、1.58、1.47、1.20、1.24、0.39、0.66、0.14，P＞0.05）。三组小鼠视网膜厚度与神经节细胞层厚度比较：DM组较正常组明显降低，而DM-KO较DM组明显增加，差异均有统计学意义（F=30.43、7.81，P＜0.000 1、0.01）。三组小鼠a波、b波振幅比较：DM组较正常组明显下降，而DM-KO较DM组明显上升，差异均有统计学意义（F=16.46、35.58，P＜0.001、0.000 1）。与DM组相比，DM-KO组筛选出184个DEG，其中39个上调基因，145个下调基因。MCODE插件分析结果表明，Col1a2、Fbln1、Fbn1、Col6a3、Fmod、Ogn、TGF-β、Mfap4、Vcan、Nid2、Col18a1为DEG中核心基因；Cytohubba插件分析结果表明，Col1a2、Mrc1、Cd47、Fbn1、Cybb、Cd163、Fbln1、Fmod、Adgre1、Col6a3为DEG中核心基因。GO功能富集分析结果显示，在细胞组分中，血红蛋白复合体、主要组织相容性抗原Ⅱ类蛋白复合物、顶端膜、炎症小体复合物、免疫突触被显著富集；在生物过程中，细菌反应、炎症反应、免疫系统过程、低氧反应、细胞粘附被显著富集。三组小鼠IL-8、TGF-β、IFN-γ、NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相对表达量比较：DM组较正常组明显上升，而DM-KO较DM组明显下降，差异均有统计学意义（F=12.43、15.41、70.09、29.04、11.79、41.28，P＜0.01）。结论 RasGRP4基因缺失通过抑制炎症因子分泌和NLRP3炎症小体通路激活对DR发挥治疗作用。

糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病最常见的神经微血管并发症，也是糖尿病患者视力受损和失明的常见原因，但其发病机制尚不明确^[1]。长期的高血糖刺激会激活多元醇途径、己糖胺生物合成途径、蛋白激酶C途径，并导致晚期糖基化终产物的积累，进而引起视网膜活性氧蓄积及氧化应激，同时激活炎症反应，因此DR也被认为是一种慢性低度炎症性疾病^[2-3]。Ras鸟嘌呤核苷酸释放蛋白（RasGRP）是一个由四种鸟嘌呤核苷酸交换因子组成的家族，可正向调节Ras和相关的鸟苷三磷酸酶^[2]。RasGRP4是RasGRP家族的新成员，主要在肥大细胞、中性粒细胞、T细胞中表达^[3]。RasGRP4是调节肥大细胞炎症因子释放的关键因子，当肥大细胞RasGRP4缺失时，白细胞介素（IL）-1β和肿瘤坏死因子-α的信使RNA（mRNA）表达水平显著下降^[4]。同时，RasGRP4也是中性粒细胞G蛋白偶联受体的中心枢纽，激活磷酸肌醇3-激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶信号通路，诱发炎症反应^[5]。目前RasGRP4在DR发生和发展中的作用尚不明确。为此，本研究采用RasGRP4基因敲除糖尿病小鼠，观察RasGRP4基因缺失对糖尿病小鼠视网膜结构和功能的影响，并通过转录组测序联合生物信息学分析探究RasGRP4在DR中的作用机制。现将结果报道如下。

1 材料和方法

饲养环境及实验操作均符合国家科学技术委员会《实验动物管理条例》规定，并获得天津医科大学眼科医院实验动物伦理委员会许可[许可证号：TJYY20231202894]。

1.1 实验动物及主要材料

6周龄健康雄性C57BL/6J小鼠12只，体重（21.0±0.82）g，无特定病原体级，购自北京斯贝福生物技术有限公司。6周龄RasGRP4基因敲除小鼠6只，体重（19.5±1.38）g，天津医科大学朱宪彝纪念医院周赛君教授惠赠。所有小鼠均饲养于天津医科大学眼科医院研究所动物实验中心，光照12 h/12 h昼夜明暗交替，温度（23±2）℃，湿度45%～65%，自由进食和饮水。

柠檬酸钠缓冲液（SSC）、磷酸盐缓冲液、无菌去离子水（北京索莱宝科技有限公司）；链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司）；EZ-press RNA纯化试剂盒（美国EZBioscience公司）；Lysis buffer裂解液（美国Invitrogen公司）；LightCycler 480 SYBR Green I Master、血糖仪、实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）系统（德国Roche公司）；光相干断层扫描（OCT）仪（德国Heidelberg公司）；视网膜电图（ERG）设备（美国Phoenix Technologies公司）。

1.2 实验分组及建模

将C57BL/6J小鼠分为正常组、糖尿病组（DM组），每组6只；RasGRP4基因敲除小鼠6只作为RasGRP4基因敲除糖尿病组（DM-KO组）。DM组与DM-KO组小鼠给予高脂饮食喂养14 d后，禁食12 h，按85 mg/kg的剂量腹腔注射STZ。正常组小鼠给予正常饮食喂养14 d后，禁食12 h，腹腔注射等体积SSC作为溶剂对照。DM组与DM-KO组小鼠STZ注射后7 d，使用取血针刺破尾静脉取血，以小鼠血糖水平＞16.7 mmol/L为建模成功，继续维持高脂饮食，每2周监测1次血糖、体重。

1.3 OCT及ERG检查

建模后3个月，各组小鼠腹腔注射4%水合氯醛400 mg/kg麻醉，复方托吡卡胺滴眼液点眼散瞳，行OCT检查，采集眼底图像和视网膜横断面图像并测量视网膜总厚度及神经节细胞层（GCL）厚度。

ERG检测暗适应条件下各组小鼠视网膜总体功能。建模后3个月，各组小鼠腹腔注射4%水合氯醛400 mg/kg麻醉和丙美卡因滴眼液点眼，麻醉期间给予复方托吡卡胺滴眼液散瞳。将两电极分别安装于小鼠头部及尾部用于记录电反应。应用1.0 cd.s/m²闪光刺激，观察小鼠ERG波形并记录a波、b波振幅。

1.4 转录组测序、差异表达基因（DEG）筛选及生物信息学分析

建模后3个月，DM组和DM-KO组小鼠过量麻醉处死，摘除眼球，取小鼠视网膜于对应编号研磨破碎管中。加入1 ml组织裂解液及研磨珠，放入研磨机研磨120 s，研磨均匀后静置5 min，使其裂解充分，12 000×g离心5 min。将上清转移到新的离心管中并加入300 μl氯仿/异戊醇混合液（24∶1），颠倒剧烈震荡混匀，12 000×g离心8 min。将上清转移到新的离心管中并加入上清体积2/3的异丙醇，颠倒混匀，−20℃静置2 h后，17 500×g离心25 min，弃上清后加入0.9 ml 75%乙醇，颠倒混匀，17 500×g离心3 min。弃上清后开盖晾干5 min，后加入200 μl 超纯水重悬沉淀。取适量RNA样品，适温破坏二级结构，并用oligo磁珠富集mRNA，然后加入中断试剂将富集的mRNA片段化。配制反应体系后根据反应程序合成双链cDNA并添加接头及A碱基。配制PCR及环化反应体系后，根据反应程序扩增产物并将其转化为单链环形产物。对单链环状DNA分子进行滚环复制，并将形成的DNA纳米球添加入DNA纳米芯片上的网状小孔内，通过联合探针锚定聚合技术进行测序。

测序数据使用SOAPnuke（v1.5.6）进行过滤。使用Dr.Tom多组学数据挖掘系（https://biosys.bgi.com）进行数据分析、绘图及挖掘。使用HISAT2（v2.1.0）软件将过滤后数据比对到参考基因组上。使用RSEM（v1.3.1）软件进行基因表达定量。标准化后，根据模型进行假设检验概率（P值）计算，多重假设检验校正，得到调整后的P值。使用DESeq2（v1.4.5）对基因表达进行差异分析，以|log2[差异表达倍数（FC）]|＞1且P＜0.05为条件筛选DEG^[6]。使用ggplot2（v3.5.0）绘制火山图。使用Phyper对DEG进行基因本体（GO，http://www.geneontology.org/）富集分析。使用STRING数据库（https://string-db.org/）分析DEG的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。使用Cytoscape v3.8.2软件对PPI网络进行可视化，并通过MCODE插件和Cytohubba插件筛选核心基因。

1.5 qPCR检测小鼠相关基因表达

qPCR检测各组小鼠视网膜IL-8、>IL-1β、转化生长因子-β（TGF-β）、干扰素-γ（IFN-γ）、NOD样受体热蛋白结构域蛋白3（NLRP3）、半胱天冬酶-1（Caspase-1）等基因的mRNA相对表达量。建模后3个月，过量麻醉处死小鼠，摘除眼球剥离视网膜，研磨破碎后加入Lysis buffer裂解液提取总RNA，使用EZ-press RNA纯化试剂盒提取总RNA，检测RNA浓度和纯度，逆转录合成cDNA。反转录试剂逆转录成cDNA，按相应基因配置SYBR Green qPCR扩增反应体系进行qPCR检测。所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。置于qPCR仪中进行扩增并输出循环阈值（Cq值），以β-肌动蛋白（β-actin）为内参照，依照公式2^-ΔΔCq计算mRNA的相对表达量。实验重复3次。

表1 引物序列

表选项

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检测基因	正向引物（5'→3'）	反向引物（5'→3'）
IL-8	GGTGATATTCGAGACCATTTACTG	GCCAACAGTAGCCTTCACCCAT
TGF-β	TGATACGCCTGAGTGGCTGTCT	CACAAGAGCAGTGAGCGCTGAA
IFN-γ	CAGCAACAGCAAGGCGAAAAAGG	TTTCCGCTTCCTGAGGCTGGAT
NLRP3	TCACAACTCGCCCAAGGAGGAA	AAGAGACCACGGCAGAAGCTAG
Caspase-1	GGCACATTTCCAGGACTGACTG	GCAAGACGTGTACGAGTGGTTG
IL-1β	TGGACCTTCCAGGATGAGGACA	GTTCATCTCGGAGCCTGTAGTG
β-actin	TAAGGCCAACCGTGAAAAG	ACCAGAGGCATACAGGGACA
注：IL：白细胞介素；TGF-β：转化生长因子-β；IFN-γ：干扰素-γ；NLRP3：NOD样受体热蛋白结构域蛋白3；Caspase-1：半胱天冬酶-1；β-actin：β-肌动蛋白

1.6 统计学方法

使用SPSS17.0软件进行统计学分析。计量数据以均数±标准差（x±s）表示。两组间比较采用t检验；三组间比较采用单因素方差分析。采用GraphPad Prism 10.0软件对所获得数据进行图表整理。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DM组与DM-KO组小鼠血糖及体重检测

建模后7 d，DM组与DM-KO组小鼠静脉血的血糖开始上升，于建模后11周到达顶峰之后略有下降，但始终＞16.7 mmol/L。同时，DM组与DM-KO组小鼠体重在建模后7 d开始下降，之后持续上升。建模后8、9、11、13、15、17、19、21周，DM-KO组与DM组小鼠血糖、体重比较，差异均无统计学意义（t=0.12、2.02、0.22、0.10、0.59、0.41、1.35、0.31、1.12、1.58、1.47、1.20、1.24、0.39、0.66、0.14，P＞0.05）（图1）。

图1 DM组与DM-KO组小鼠血糖及体重比较（n=6）

1A、1B分别示血糖、体重 DM组：糖尿病组，高脂饮食，按85 mg/kg的剂量腹腔注射链脲佐菌素；DM-KO组：RasGRP4基因敲除糖尿病组，敲除RasGRP4基因，高脂饮食，按85 mg/kg的剂量腹腔注射链脲佐菌素

图选项

上调基因	log₂（FC）	下调基因	log₂（FC）
Asdurf	5.26	H3c15	−6.72
Xlr4a	5.09	Gstm2	−6.00
Krt4	4.32	Ces1d	−5.64
Cfap299	4.00	Gdf1	−5.40
Gm36327	3.89	Best2	−4.56
Gm21992	3.35	Ch25h	−4.32
Kcnh3	3.17	Fbln1	−4.17
Igfals	3.00	Mfap4	−4.17
Apol10a	3.00	Cldn2	−4.14
Capn11	2.66	Ugt1a7c	−4.08
注：FC：差异倍数；DEG：差异基因；DM组：糖尿病组，高脂饮食，按85 mg/kg的剂量腹腔注射链脲佐菌素；DM-KO组：RasGRP4基因敲除糖尿病组，敲除RasGRP4基因，高脂饮食，按85 mg/kg的剂量腹腔注射链脲佐菌素；正常组：正常饮食，腹腔注射等体积柠檬酸钠缓冲液

1.	Simó-Servat O, Hernández C, Simó R. Diabetic retinopathy in the context of patients with diabetes[J]. Ophthalmic Res, 2019, 62(4): 211-217. DOI: 10.1159/000499541.
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《中华眼底病杂志》

优先发表沉默RasGRP4基因对糖尿病小鼠视网膜病变的治疗作用

摘要 全文 图表 视频 参考文献 施引文献 补充材料

1 材料和方法

1.1 实验动物及主要材料

1.2 实验分组及建模

1.3 OCT及ERG检查

1.4 转录组测序、差异表达基因（DEG）筛选及生物信息学分析

1.5 qPCR检测小鼠相关基因表达

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 DM组与DM-KO组小鼠血糖及体重检测

2.2 RasGRP4基因敲除抑制视网膜厚度下降

2.3 RasGRP4基因敲除抑制ERG a波、b波振幅下降

2.4 转录组学分析结果

2.5 敲除RasGRP4基因抑制小鼠视网膜炎症和激活NLRP3炎症小体通路

3 讨论

1 材料和方法

1.1 实验动物及主要材料

1.2 实验分组及建模

1.3 OCT及ERG检查

1.4 转录组测序、差异表达基因（DEG）筛选及生物信息学分析

1.5 qPCR检测小鼠相关基因表达

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 DM组与DM-KO组小鼠血糖及体重检测

2.2 RasGRP4基因敲除抑制视网膜厚度下降

2.3 RasGRP4基因敲除抑制ERG a波、b波振幅下降

2.4 转录组学分析结果

2.5 敲除RasGRP4基因抑制小鼠视网膜炎症和激活NLRP3炎症小体通路

3 讨论

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