目的 構建nesprin蛋白siRNA慢病毒載體（LV-siNesprin），感染骨髓間充質干細胞（MSCs），觀察nesprin蛋白對MSCs的影響?！》椒ā♂槍esprin靶基因序列設計并合成4對miRNA oligo，并將4對oligo退火成雙鏈DNA，測序鑒定。將4種miRNA干擾質粒（SR-1、SR-2、SR-3、SR-4）轉入大鼠血管平滑肌細胞，用反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）和蛋白印跡法（Western blotting）檢測干擾效應，篩選最佳干擾序列；將最佳干擾序列和pDONR221載體進行重組反應，獲得含干擾序列的入門載體，再將入門載體和慢病毒表達的目的載體pLenti6/V5-DEST進行重組反應獲得含干擾序列的LV-siNesprin＋綠色熒光蛋白（GFP），包裝慢病毒，測定病毒滴度。LV-siNesprin＋GFP轉染MSCs，Western blotting鑒定比較nesprin蛋白表達情況（分為LV-siNesprin＋GFP組、GFP對照組和正常細胞組），用4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色觀察細胞核形態(tài)改變和四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測MSCs感染LV-siNesprin后24 h、48 h、72 h和96 h的增殖情況（分為LV-siNesprin＋GFP組、GFP對照組和正常細胞組）?！〗Y果 測序證實合成的4對miRNA oligo正確，RT-PCR和Western blotting篩選出最佳干擾miRNA質粒SR-3，成功構建LV-siNesprin，包裝慢病毒，病毒懸液的活性滴度為1×106 ifu/ml。LV-siNesprin轉染MSCs后，nesprin蛋白表達明顯下降，出現(xiàn)細胞核融合、核碎裂等形態(tài)學改變；MTT法檢測顯示，LV-siNesprin＋GFP組MSCs增殖速度較GFP對照組和正常細胞組減慢?！〗Y論 Nesprin蛋白對MSCs核膜穩(wěn)定維持核膜空間結構起作用，并利于細胞增殖更新。
目的構建 BMP-2基因重組慢病毒載體，并檢測其轉染豬BMSCs 后BMP-2表達活性及誘導BMSCs成骨分化情況，為進一步構建組織工程骨軟骨奠定基礎。 方法取2只2月齡巴馬香豬（體重約15 kg）髂骨骨髓，采用密度梯度離心法分離培養(yǎng)BMSCs，并傳代。利用基因重組技術構建 BMP-2基因重組慢病毒載體，并以感染復數(shù)（multiplicity of infection，MOI）10、25、50、100、200轉染第2代BMSCs，通過熒光顯微鏡及倒置相差顯微鏡觀察確定最佳MOI值。以最佳 MOI 值感染 BMSCs作為實驗組，空載體轉染的 BMSCs（空載體組）及未轉染的 BMSCs（空白組）作為對照，通過 RT-PCR、免疫組織化學染色、Western blot檢測 BMP-2 mRNA及蛋白在 BMSCs 中的表達，并應用ALP染色、ALP活性檢測及茜素紅鈣結節(jié)染色檢測其成骨分化情況。 結果經RT-PCR基因測序鑒定 BMP-2基因重組慢病毒載體構建成功，轉染 BMSCs后熒光顯微鏡下可見綠色熒光表達，且MOI值為 100 時為最佳表達。RT-PCR 提示 BMP-2 基因成功轉染至 BMSCs 中；免疫組織化學染色及 Western blot檢測示轉染后BMSCs并可持續(xù)、穩(wěn)定、高效表達 BMP-2蛋白；培養(yǎng)后2周BMSCs可見ALP表達及鈣結節(jié)形成。 結論成功構建 BMP-2基因重組慢病毒載體并轉染豬 BMSCs，BMP-2 基因轉染入 BMSCs 后能持續(xù)、穩(wěn)定、高效表達 BMP-2 基因和蛋白，并成功誘導 BMSCs 向成骨細胞分 化。
目的探討重組慢病毒（lentivirus，LVs）介導超極化激活的環(huán)核苷酸門控陽離子通道4（hyperpo-larization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel 4，HCN4）基因轉染大鼠BMSCs構建生物起搏細胞的可行性。 方法選取3～5周齡SD大鼠，采用改良全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)BMSCs。以LVs作為轉染載體，增強綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）為標記，構建LVs-HCN4-EGFP病毒液。取第3代BMSCs分別轉染LVs-HCN4-EGFP病毒液（實驗組）和LVs-EGFP空白病毒液（對照組），熒光顯微鏡觀察轉染24、48、72 h后兩組綠色熒光表達情況，72 h時Western blot檢測HCN4蛋白表達；電生理檢測實驗組轉染72 h后BMSCs的起搏電流。 結果實驗組BMSCs 形態(tài)正常、生長良好；48 h后熒光顯微鏡下可見散在的綠色熒光，轉染效率約10%；72 h熒光表達稍增多，轉染效率為20%～25%。對照組未見綠色熒光表達。Western blot檢測示轉染72 h后，實驗組可見與HCN4蛋白相對分子質量相同的條帶表達，而對照組僅有微弱表達；實驗組蛋白條帶灰度值為33.75 ± 0.41，顯著高于對照組的23.39 ± 0.33（t=17.524，P=0.013）。實驗組轉染后的BMSCs檢測到起搏電流，并能被CsCl完全阻斷，符合起搏電流特點。結論重組LVs介導HCN4基因成功轉染大鼠BMSCs，并檢測到HCN4蛋白表達及起搏電流。
目的構建插頭/翼狀螺旋轉錄因子C2（homo sapiens forkhead box C2，F(xiàn)oxc2）基因慢病毒載體并轉染兔BMSCs，檢測其在BMSCs中的表達，為進一步應用攜帶Foxc2基因的BMSCs移植治療股骨頭缺血性壞死奠定實驗基礎。 方法通過RT-PCR法獲得人Foxc2基因片段，將該片段克隆至包含綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的慢病毒載體LV-GFP中，重組獲得Foxc2慢病毒質粒，將其與pGC-LV載體、pHelper1.0載體、pHelper2.0載體共轉染293T細胞，獲得Foxc2基因慢病毒載體；檢測病毒滴度。分離、培養(yǎng)兔BMSCs，以Foxc2基因慢病毒載體轉染第3 代BMSCs，通過熒光表達法判定最佳感染復數(shù)（multiplicity of infection，MOI），并以最佳MOI進行轉染，倒置熒光顯微鏡觀察、Western blot法檢測轉染1、3、7 d BMSCs中Foxc2的表達；對轉染后BMSCs行成骨誘導，茜素紅染色法觀察礦化物結節(jié)形成情況。 結果成功構建Foxc2基因慢病毒載體，經酶切及測序鑒定完全正確，能轉染293T細胞并表達GFP，病毒滴度為2 × 108 TU/mL。Foxc2基因慢病毒轉染BMSCs的最佳MOI為200，轉染BMSCs 3 d后經免疫熒光檢測84.5% ± 4.8%的BMSCs可表達Foxc2。Western blot 結果顯示Foxc2在BMSCs中高表達，且在7 d內表達水平逐漸升高。成骨誘導培養(yǎng)2周后，茜素紅染色示細胞質中有大量紅色的鈣化基質沉積。 結論成功構建并包裝獲得較高滴度的Foxc2基因慢病毒載體，慢病毒可高效并穩(wěn)定轉染BMSCs，F(xiàn)oxc2表達增加，為基因治療股骨頭缺血性壞死奠定了基礎。
【摘 要】 目的 構建NEP1-40（Nogo extra cellular peptide residues 1-40）基因慢病毒表達載體，為后續(xù)轉染目的細胞奠定基礎，并實現(xiàn)在細胞中高效、穩(wěn)定表達。 方法 從含有 NEP1-40 基因的 cDNA 文庫中，利用PCR 方法釣取NEP1-40 基因編碼區(qū)片段。將目的基因與酶切線性化的載體pGC-FU 進行定向連接，其產物轉化細菌感受態(tài)細胞。對長出的克隆先進行菌落PCR 鑒定，再對PCR 鑒定陽性的克隆進行測序和比對分析，比對正確的克隆即為構建成功的目的質粒。將構建成功的目的質粒和兩種輔助包裝質粒共轉染293T 細胞，包裝成慢病毒，熒光顯微鏡下觀察慢病毒轉染293T細胞后熒光表達情況，采用Western blot 檢測NEP1-40 及綠色熒光蛋白融合蛋白表達情況。 結果 PCR 產物經電泳分析表明成功獲取NEP1-40 基因cDNA 克隆，測序提示慢病毒轉染質粒連接構建正確；熒光表達檢測顯示293T 細胞中產生慢病毒顆粒；Western blot 顯示NEP1-40 在細胞內穩(wěn)定表達。 結論 成功構建NEP1-40 基因慢病毒表達載體，為后續(xù)轉染目的細胞后從分子水平探討NEP1-40 基因功能奠定了實驗基礎。
目的 構建人microRNA-210（miR-210）慢病毒重組載體并轉染人臍靜脈內皮細胞株（human umbilical vein endothelial cells 12，HUVE-12），探討其過表達對HUVE-12 成血管的影響，為研究血管再生機制提供實驗模型。方法 構建pGCSIL-GFP-pre-miR-210 重組質粒表達載體并轉染HUVE-12，熒光顯微鏡觀察GFP 陽性表達細胞數(shù)及實時熒光定量PCR 法檢測miR-210 表達變化；細胞分為空病毒對照組（LV-GFP 對照組）和miR-210 轉染組（LV-miR-210-GFP 組），流式細胞儀檢測各組細胞ephrinA3 表達變化；ELISA 檢測細胞培養(yǎng)上清中VEGF 含量；將兩組細胞分別接種于Matrigel 觀察血管形成能力。 結果 重組載體經酶切、測序鑒定正確，GFP 表達強度在轉染后48 ～ 72 h 達峰值；實時熒光定量PCR 檢測結果顯示：LV-miR-210-GFP 組miR-210 表達水平較LV-GFP 對照組增加9.72 倍（t= —11.10，P=0.00）。流式細胞儀檢測結果顯示LV-miR-210-GFP 組ephrinA3 陽性細胞率為12.52% ± 0.67%，明顯較LV-GFP 對照組（73.22% ± 1.45%）降低（t= —66.12，P=0.00）；ELISA 檢測結果顯示LV-miR-210-GFP 組細胞上清中VEGF 含量顯著高于LV--GFP 對照組（[ 305.29 ± 16.52）pg/mL vs.（42.52 ± 3.11）pg/mL]（t= —27.06，P=0.00）；血管形成能力實驗顯示LV-miR-210-GFP 組毛細血管管腔數(shù)為17.33 ± 6.33，較LV-GFP 對照組（6.33 ± 2.33）顯著增加（t= —2.83，P=0.04）。 結論 成功構建miR-210 慢病毒重組載體，并能在HUVE-12 中穩(wěn)定表達，過表達miR-210 能明顯增強HUVE-12 血管形成能力，為進一步研究miR-210 調控血管新生的分子機制奠定了實驗基礎。
目的 構建豬TGF-β1 重組慢病毒表達載體，并轉染BMSCs，為構建組織工程骨軟骨提供TGF-β1 修飾的BMSCs，作為持續(xù)、高效的種子細胞。 方法 將已獲取的目的基因TGF-β1 cDNA 包裝至慢病毒載體中，通過PCR及基因測序對陽性克隆進行鑒定，并測定病毒滴度。取2 月齡巴馬香豬（體重約15 kg）骨髓制備BMSCs，取第2 ～ 3代用于實驗。用TGF-β1 重組慢病毒載體以感染復數(shù)（multiplicity of infection， MOI）為10、50、70、100、150 分別轉染BMSCs，通過激光共聚焦顯微鏡觀察，并以Western blot 檢測不同MOI 值的轉染效果，確定最佳MOI 值。用TGF-β1 重組慢病毒載體以最佳MOI 值感染BMSCs 作為實驗組，以空載體轉染的BMSCs（空載體組）及未轉染的BMSCs（空白組）作為對照，通過RT-PCR、免疫細胞化學染色、ELISA 等方法檢測TGF-β1 基因及蛋白在BMSCs 中的表達情況，并檢測Ⅱ型膠原表達情況。 結果 經PCR 及基因測序鑒定TGF-β1 重組慢病毒表達載體構建成功，并成功轉染BMSCs，激光共聚焦顯微鏡下可觀察到強綠色熒光；Western blot 示MOI 為70 時轉染效果最佳；RT-PCR 示實驗組TGF-β1 基因的表達量明顯高于空載體組及空白組，差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）；免疫細胞化學染色示實驗組TGF-β1 蛋白及Ⅱ型膠原呈陽性表達，而空載體組及空白組呈弱陽性或陰性表達；ELISA 示實驗組TGF-β1 蛋白至轉染后21 d 仍有較高表達。 結論 TGF-β1 重組慢病毒表達載體可成功轉染BMSCs，TGF-β1 蛋白可長期、穩(wěn)定表達，促使BMSCs 向成軟骨細胞方向分化。
目的 構建可誘導表達hBMP-2 的慢病毒載體，并研究hBMP-2 在人臍血間充質干細胞（human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，HUMSCs）中的可誘導性表達。 方法 以pcDNA-hBMP-2 為模板，通過PCR 反應獲取hBMP-2，運用GATEWAY 技術構建pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2、pLV/EXPN2-Puro-EF1A- 反向反式激活因子（reverse transactivator，rtTA），通過PCR 鑒定重組慢病毒載體構建。將重組慢病毒與輔助質粒共同轉染293FT 細胞，包裝成能表達hBMP-2 的可控性慢病毒，并測定病毒滴度。用病毒轉染HUMSCs，使用強力霉素進行誘導，分別在相同誘導時間（48 h）不同誘導濃度（0、10、100 ng/mL，1、10、100 μg/mL）及不同誘導時間（12、24、48、72 h）相同誘導濃度（10 μg/mL）兩種情況下用ELISA 法測定hBMP-2 的表達情況。對轉染前后的HUMSCs 進行成骨誘導，用茜素紅染色法觀察礦化物結節(jié)形成情況。 結果 成功構建了攜帶hBMP-2 的可控性慢病毒載體pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2、pLV/EXPN2-Puro-EF1A-rtTA，并獲得相應的病毒，病毒滴度分別為3.5 × 108 TU/mL 和9.5 × 107 TU/mL；病毒轉染HUMSCs 后，HUMSCs 可通過強力霉素的誘導可控性表達hBMP-2。在相同誘導時間情況下，強力霉素10 μg/mL 時誘導表達最強；而在相同誘導濃度下，hBMP-2 的表達在誘導48 h 達峰值。HUMSCs 成骨誘導培養(yǎng)2 周后，茜素紅染色示胞漿中有大量紅色的鈣化基質沉積。 結論 通過GATEWAY 技術可以建立攜帶hBMP-2 目的基因的可控性慢病毒載體，為進一步研究hBMP-2 誘導HUMSCs 成骨分化治療骨壞死模型奠定實驗基礎，并提供了一種新的實驗思路。
目的 構建共表達增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因和人胰島素（insulin）基因的慢病毒載體，探討其對人臍帶間充質干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）的轉染情況，為今后組織工程脂肪構建與體內回植研究奠定基礎。 方法 采用DNA 重組技術，將insulin 基因克隆至帶EGFP 的慢病毒表達載體pLenti6.3- 內部核糖體進入位點序列（internal ribosome entry site，IRES）-EGFP 中，篩選陽性克隆，并用脂質體介導法將慢病毒包裝系統(tǒng)和帶目的基因的質粒pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP 共同轉染到293T 細胞內包裝病毒，熒光倒置相差顯微鏡觀察包裝細胞報告基因的表達情況。收集病毒上清，純化濃縮，測定重組病毒的滴度。取足月兒臍帶以組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)hUCMSCs，以不同感染復數(shù)（multiple of infection，MOI，分別為0、1、3、5、7、10、15、20）的重組慢病毒感染hUCMSCs，通過報告基因綠色熒光蛋白的表達篩選最適MOI；以最適MOI 重組慢病毒感染hUCMSCs，應用實時熒光定量PCR 及Western blot 法分別檢測細胞中insulin 基因及insulin 蛋白水平的表達情況。 結果 成功構建了共表達insulin 基因和EGFP 基因的重組慢病毒載體pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP，并對其成功包裝、純化及濃縮，病毒滴度為1.3 × 108 TU/mL。不同MOI 的重組慢病毒感染hUCMSCs 后，通過綠色熒光蛋白表達的陽性細胞數(shù)篩選其最適MOI 為10，此時對細胞的轉染效率可達到90%。實時熒光定量PCR 檢測示轉染組insulin mRNA 表達陽性，未轉染組為陰性；Western blot 檢測示轉染組細胞內及上清液insulin 蛋白表達陽性，未轉染組均為陰性。 結論 構建的攜帶insulin基因的重組慢病毒載體pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP 可有效轉染hUCMSCs，表達insulin 蛋白。
目的 構建攜帶人肝細胞生長因子（human hepatocyte growth factor，hHGF）基因的慢病毒，感染大鼠BMSCs，建立穩(wěn)定表達hHGF 的BMSCs/hHGF 細胞。 方法 從含hHGF 基因的質粒pcDNA-hHGF 中，用PCR 法獲取hHGF 全長基因，與慢病毒載體pGC-E1 分別進行Age Ⅰ酶切，產物定向連接，轉化后行PCR 鑒定和測序，構建hHGF 慢病毒表達質粒。脂質體Lipofectamine 2000 介導慢病毒載體三質粒pGC-E1-hHGF、pHelper 1.0、pHelper 2.0 共轉染293T細胞。收集病毒超濾離心濃縮，實時定量PCR 測定滴度。將hHGF 慢病毒感染BMSCs，熒光顯微鏡觀察熒光表達，確定最佳感染復數(shù)（multiplicities of infection，MOI）值，以最佳MOI 值感染細胞，流式細胞儀檢測感染效率，ELISA 法檢測細胞培養(yǎng)上清hHGF 分泌水平，RT-PCR 檢測hHGF 基因的表達。 結果 實驗成功構建攜帶hHGF 基因的慢病毒，滴度達1 × 108 TU/mL。hHGF 慢病毒高效率感染BMSCs，最佳MOI 值為10。流式細胞儀檢測感染效率達98%，且在感染后28 d BMSCs 仍穩(wěn)定表達強烈的綠色熒光。細胞培養(yǎng)上清可檢測到hHGF 因子，術后5 d 達高峰，達40.5 ng/mL，這種高水平分泌可持續(xù)至感染后28 d。RT-PCR 檢測出hHGF 基因的表達。 結論 通過慢病毒載體將hHGF 基因穩(wěn)定感染至BMSCs 細胞，可獲得長期穩(wěn)定的表達，并持續(xù)分泌hHGF 因子。