目的〓〖HTSS〗構建重組人骨形成蛋白4(human bone morphogenetic protein 4, hBMP-4)基因腺相關病毒載體。方法根據(jù)hBMP-4的基因序列設計引物,上游引入EcoRⅠ位點,下游引入Sal Ⅰ位點,以EX-A0242-M01-hBMP-4為模板擴增目的基因。將hBMP4基因克隆入pUC18載體中,獲得重組質粒pUC18-hBMP-4。然后用EcoRⅠ與SalⅠ酶切pUC18-hBMP-4及質粒pSNAV,回收酶切片段,T4 DNA連接酶16℃過夜,轉化大腸桿菌DH5α感受肽細胞,篩選陽性克隆獲得pSNAV-hBMP-4,EcoRⅠ/SalⅡ雙酶切鑒定,并行全基因測序。轉染BHK21細胞,G418篩選培養(yǎng),獲得抗藥克隆細胞株。HSV1rc/△UL2感染,包裝此細胞株并收獲病毒載體AAV-hBMP-4。行DNA點雜交法測定病毒滴度,SDS-PAGE分析判斷病毒純度。結果 PCR電泳及酶切鑒定表明,pSNAV-hBMP-4重組成功,基因測序顯示裝入pSNAV質粒中的hBMP-4基因正確;AAV-hBMP-4病毒的大致滴度為1.5×10 12 μg/ml,分泌蛋白濃度為0.124 mg/ml,病毒載體純度在95%以上。結論 實驗獲得的病毒載體滴度高、感染性好,可以滿足骨組織工程的需要。