【摘要】目的探討β-連環(huán)蛋白異常表達和c-myc陽性表達在肝門部膽管癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及其機理。方法應用免疫組織化學SP法對42例肝門部膽管癌及10例膽管良性病變組織中的β-連環(huán)蛋白和c-myc蛋白進行檢測，并結合臨床資料進行分析。結果β-連環(huán)蛋白在10例膽管良性病變組織中均呈正常表達，且c-myc均呈陰性表達； 而在42例膽管癌患者中30例癌組織細胞胞漿內的β-連環(huán)蛋白的異常表達率明顯高于膽管良性病變組織，且異常表達率與肝門部膽管癌的淋巴結轉移顯著相關（P＜0.05），而與肝門膽管癌大小、分化程度和侵襲狀況無關（Pgt;0.05）。膽管癌中c-myc表達陽性率與肝門膽管癌的大小、侵襲狀況及淋巴結轉移無關（Pgt;0.05），而與肝門部膽管癌的分化程度密切相關（P＜0.05）。β-連環(huán)蛋白異常表達與 c-myc陽性表達在肝門部膽管癌中呈顯著的正相關性（r=0.324,P＜0.01）。結論肝門部膽管癌細胞中存在β-連環(huán)蛋白異常表達和c-myc蛋白陽性表達的現(xiàn)象，與膽管癌的一些生物學行為密切相關。β-連環(huán)蛋白的異常表達可能是肝門部膽管癌轉移的分子機理之一。
目的探討生長抑素類似物8肽（SS8）對人原發(fā)性肝癌細胞凋亡和cmyc蛋白表達的影響。方法體外培養(yǎng)肝癌細胞SMMC7721，用10 μg/ml SS8處理后，流式細胞儀檢測肝癌細胞凋亡率和cmyc蛋白的表達。結果與對照組相比，SS8使實驗組S期和G2/M期細胞數(shù)減少、G0/G1期細胞數(shù)增加，兩組細胞的凋亡率分別為6.1%和14.2%，差異有顯著性意義（P＜0.05）。經(jīng)SS8作用24 h后，實驗組cmyc蛋白表達水平為0.833±0.035，與對照組相比差異無顯著性意義（P＞0.10），而在SS8作用48、72、96、120和144 h后，實驗組cmyc蛋白表達水平分別為0.818±0.04、0.721±0.029、0.669±0.026、0.648±0.045和0.642±0.028，較對照組顯著降低（P＜0.05）。結論SS8有誘導肝癌細胞SMMC7721凋亡和降低cmyc蛋白表達的作用。
目的 設計、構建并篩選出轉染至人骨肉瘤細胞系OS-9901，對c-myc 沉默效果最佳的復制缺陷型重組腺病毒質粒pAd-c-myc- 短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）包裝出表達c-myc-shRNA 的重組腺病毒，并測定其滴度。 方法 設計有shRNA 結構的3 對單鏈寡核苷酸（ss oligos），經(jīng)變性退火為雙鏈寡核苷酸（ds oligos），插入穿梭質粒pENTR/U6 載體，測序正確后，經(jīng)LipofectamineTM2000 陽離子脂質體介導入人骨肉瘤細胞系OS-9901，采用RTPCR篩選對c-myc 沉默效果最佳的穿梭質粒pENTR/U6-shRNA，然后與腺病毒骨架質粒行同源重組，篩選出正確重組子。采用293A 細胞包裝出表達c-myc-shRNA 的復制缺陷型重組腺病毒，觀察其細胞病變效應（cytopathic effect，CPE），采用病毒顆粒法（viral particles，VP）和50% 組織培養(yǎng)感染劑量法（50% tissue culture infective dose，TCID50）測定病毒滴度。 結 果 電泳驗證后的ds oligos 插入穿梭質粒pENTR/U6 載體，測序結果提示構建的pENTR/U6-shRNA 質粒正確。從3 對ds oligos 通過RT-PCR 方法篩選出對c-myc 沉默效果最佳的穿梭質粒pENTR/U6-shRNA，經(jīng)Pac Ⅰ酶切線性化后同源重組成功構建了介導c-myc-shRNA 復制缺陷型重組腺病毒，CPE 和空泡現(xiàn)象 3 d 開始出現(xiàn)，6 d 更加明顯。采用VP法測定的第1 代腺病毒滴度為5.23 × 109 VP/mL，經(jīng)3 ～ 4 代擴增后可達2.26 × 1012 VP/mL。TCID50 證實病毒滴度為10-3.8/0.1 mL。 結論 通過RNA 干擾技術，體外成功構建了介導shRNA-c-myc 復制缺陷型重組腺病毒。
目的 探討能否通過局部應用c-myc shRNA抑制慢性增生性膽管炎(CPC)增殖相關基因的表達而抑制CPC的過度增殖行為和成石潛力。方法 經(jīng)十二指腸乳頭向膽總管逆行插入5-0尼龍縫合線建立CPC動物模型(CPC組)。c-myc shRNA治療組在CPC組基礎上向膽總管內分別注入3種c-myc shRNA即分別為c-myc shRNA-1、c-myc shRNA-2及c-myc shRNA-3，另設陰性對照組和假手術組。應用HE、Massion和PAS/AB染色觀察膽管組織病理學變化，免疫組化法檢測c-myc蛋白表達，免疫熒光法檢測5-溴脫氧尿核苷(BrdU)蛋白表達，實時(RT)-PCR檢測c-myc、Mucin 3和Procollagen Ⅰ mRNA的表達，Western blot法檢測Ki-67蛋白的表達，改良Fisherman法檢測β-葡萄糖醛酸酶(β-G)的活性。結果?、倥cCPC組及陰性對照組比較，c-myc shRNA治療組的膽管黏膜上皮(HE染色)、黏膜下酸性黏液腺體(PAS/AB染色中藍色)和膽管壁膠原纖維(Massion染色藍染)的過度增生程度明顯減弱，BrdU蛋白表達也明顯減弱。②c-myc、Mucin 3和Procollagen Ⅰ mRNA,c-myc蛋白，Ki-67蛋白,以及β-G活性在c-myc shRNA治療組均明顯低于CPC組及陰性對照組(Plt;0.05)，但均高于假手術組(Plt;0.05)。結論 c-myc shRNA治療能夠有效地抑制CPC的過度增殖行為和成石潛力，可能會有助于預防膽管再狹窄和肝內膽管結石的術后復發(fā)。
目的 乙型肝炎病毒 X（hepatitis B virus X protein，HBx）蛋白通過調控蛋白編碼基因表達而廣泛參與人原發(fā)性肝細胞癌（簡稱肝癌）的發(fā)生和進展。本研究將 HBx 的調控功能拓展到非編碼 RNA 領域，探討 HBx 能否調控宿主肝癌細胞內 microRNA（miRNA）的表達，進而參與肝癌細胞生長及惡性轉化。 方法 利用高通量芯片分析及實時定量聚合酶鏈反應（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）鑒定 HBx 在肝癌細胞內誘發(fā)的 miRNA 表達變化。通過系列蛋白和 mRNA 表達分析，細胞周期及凋亡實驗以及螢光素酶報告實驗來檢測 miR-16 家族表達抑制后 HepG2 肝癌細胞的生物學變化。 結果 芯片分析結果顯示，HBx 在 HepG2 細胞內誘發(fā)了大量的 miRNAs 表達變化，其中 miR-16 家族的低表達能在 HepG2、SK-HEP-1 及 Huh7 肝癌細胞中得到重復。同時，HBx 顯著上調 miR-16 家族的靶基因 CCND1 的表達。c-myc 介導了 HBx 相關 miR-16 家族沉默，外源表達的 miR-16/15a 能通過阻滯細胞周期進展和誘導凋亡而抑制 HepG2-hbx（穩(wěn)定表達 HBx）細胞的增殖、克隆形成及非貼壁生長能力。反之，沉默 miR-16 表達能促進 HepG2 細胞的周期進展和生長。 結論 HBx 能在體外改變肝癌細胞的 miRNA 表達譜，尤其是沉默 miR-16 家族表達。c-myc 高表達介導了 HBx 下調 miR-15a/16 的過程且是 HBx 促進 HepG2 細胞惡性轉化所必須的。因此，miR-16 家族可能成為 HBV 相關肝細胞癌的治療靶點。
目的探索姜黃素對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導后肝內膽管上皮細胞中內源性 β-葡萄糖醛酸酶（β-glucoronidase，β-GD）和 c-myc 表達的影響。方法① 取對數(shù)生長期的 HIBEpiC 細胞進行分組：空白對照組（0 h 組）及 7 個不同刺激時點組，調整細胞密度為 1×104個/mL，5 個不同刺激時點組在培養(yǎng)基中加入 100 μg/mLLPS 分別刺激 1、3、6、18 及 24 h，另外取 2 份培養(yǎng)基，在 LPS 刺激 24 h 后更換為無 LPS 培養(yǎng)基，分別繼續(xù)培養(yǎng) 18 h和 24 h。② 取對數(shù)生長期的 HIBEpiC 細胞進行分組：空白對照組、LPS 組、LPS+低濃度姜黃素組、LPS+中濃度姜黃素組及 LPS+高濃度姜黃素組，調整細胞密度為 1×104個/mL。除空白對照組細胞不加入任何試劑、LPS 組僅加入 100 μg/mL LPS 外，其余 3 組在培養(yǎng)基中加入 100 μg/mL LPS 的同時，分別給予 20、40 和 80 μmol/L姜黃素干預。采用 Western blot 法檢測細胞中 c-myc 和內源性 β-GD 的表達水平。結果① 人正常肝內膽管細胞中的內源性 β-GD 和 c-myc 的表達水平隨著 LPS 作用時間的延長呈增加趨勢，各時點組的 β-GD 和 c-myc 的表達水平與 0 h 組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。② 空白對照組、LPS 組、LPS+低濃度姜黃素組、LPS+中濃度姜黃素組及 LPS+高濃度姜黃素組間兩兩比較，c-myc 和 β-GD 的表達水平的差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論姜黃素可抑制 LPS 誘導的內源性 β-GD 表達的上調，而且其抑制機制可能與抑制 c-myc 的表達有關。
目的 探討VEGF 和c-myc在膽管癌組織中的表達和二者之間的相關性及其在膽管癌發(fā)生、發(fā)展和轉移中的作用。 方法 應用免疫組化ABC法對38例膽管癌組織和20例正常膽管組織中VEGF 和c-myc的表達進行檢測。 結果 VEGF 和c-myc在膽管癌組織中的表達陽性率分別為84.2%（32/38）和65.8%（25/38），明顯高于正常膽管組織中的表達陽性率〔50.0%（10/20）和20.0%（4/20）〕，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）； VEGF與c-myc的表達呈正相關（r=0.99, P＜0.01），二者的協(xié)同表達與膽管癌的淋巴結轉移有關，而與腫瘤的分級無關。 結論 VEGF可能在膽管癌形成、發(fā)展和轉移中與c-myc基因有協(xié)同作用，且與膽管癌的淋巴結轉移有關。
目的采用可溶性支架將原癌基因c—myc反義寡核苷酸轉染靜脈移植物，觀察其對靜脈移植物內c—myc蛋白和增殖細胞核抗原（PCNA）蛋白產物表達的影響。方法50只新西蘭大耳白兔建立兔頸外靜脈頸總動脈旁路移植模型后隨機分成5組，每組10只。對照組：無支架；組1：植入單純可溶性支架；組2：植入正義c—myc寡核苷酸可溶性支架；組3：植入反義c—myc寡核苷酸可溶性支架；組4：植入不匹配c—myc寡核苷酸可溶性支架。于靜脈移植后7d、28d和90d取出靜脈移植物，采用免疫組織化學方法檢測其c—myc蛋白和PCNA蛋白的表達。結果對照組、組1、組2、組4靜脈移植術后7d、28d、90d時靜脈移植物內膜和中膜內可見大量c—myc蛋白和PCNA蛋白表達陽性的細胞，與同時間點組3比較差別均有統(tǒng)計學意義（P〈0．01）。28d、90d時5組靜脈移植物內c—myc蛋白的表達與同組7d時比較明顯增強（P〈0．01）。結論可溶性支架轉染c—myc反義寡核苷酸可顯著抑制靜脈移植物內c—myc蛋白和PCNA蛋白的表達。