支氣管哮喘( 簡稱哮喘) 作為一種異質(zhì)性疾病, 其發(fā)病機制復(fù)雜多樣, 病理生理改變和臨床表現(xiàn)同樣具有多樣性。表型( Phenotypes) 是指生物體的可觀察特征, 是基因型和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果[ 1] ; 它也是能將生物體分成不同獨立類群的一系列特征[ 2] 。近年來, 學(xué)者們對哮喘的表現(xiàn)和治療反應(yīng)的異質(zhì)性認(rèn)識不斷增加, 從哮喘的不同角度進(jìn)行觀察并歸納出多種臨床和炎癥表型。雖然對這些表型尚未達(dá)成共識, 但它有助于深入認(rèn)識哮喘的發(fā)病機制, 有助于獲得對哮喘進(jìn)行更有針對性的治療策略。 目前現(xiàn)有的哮喘的分類主要依據(jù)是疾病病因、疾病的控制水平與嚴(yán)重程度[ 3] 。這些分類往往不能很好的反映哮喘的異質(zhì)性。2009 版的哮喘防治指南( GINA) 首次將“表型”的定義引入, 并提出基于表型的分類有助于指導(dǎo)治療及判斷預(yù)后[ 3] 。雖然指南并沒有明確作出哮喘表型的分類, 但這足以顯示出學(xué)界對哮喘表型分類的關(guān)注。目前, 對哮喘的表型分類仍無統(tǒng)一的共識, 以不同的方法和分類原則可有不同的分類。
目的 慢性阻塞性肺疾病( COPD) 是一種異質(zhì)性很強的疾病。由于存在相同的生物學(xué)或生理學(xué)機制, 理論上可以將具有相同臨床表現(xiàn)、治療反應(yīng)及預(yù)后的患者歸類即可稱為一類表型。目前對各種臨床表型的研究尚不夠深入, 使COPD 的診斷、評估及治療面臨困境。將根據(jù)COPD 患者的體重指數(shù)( BMI) 、肺氣腫評分( Goddard 評分) 、呼出氣一氧化氮( FeNO) 值進(jìn)行特征研究, 以提高對 COPD 的認(rèn)識。方法 選取2011 年5 月至2012 年2 月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院呼吸科就診的穩(wěn)定期COPD 患者, 進(jìn)行相關(guān)臨床數(shù)據(jù)的采集, 包括肺功能檢查、病史詢問、COPD 評估測驗 ( CAT) 、圣·喬治呼吸問題調(diào)查( SGRQ) 、醫(yī)院焦慮抑郁評分( HAD) 、FeNO、6 分鐘步行距離試驗等。根據(jù)BMI、Goddard 評分、FeNO值分類進(jìn)行特征研究。結(jié)果 符合入選條件的穩(wěn)定期COPD 患者共 126 例。BMI 1 級患者生活質(zhì)量較差, HAD 較高, FEV1 較低, 彌散功能較差, 肺氣腫評分較高。BMI 4 級患者靜息氧飽和度較低。不能通過FeNO 將患者進(jìn)行表型分類。肺氣腫型患者BMI 較低, 彌散功能下降, 生活質(zhì)量更差。結(jié)論 可以通過BMI 及Goddard 評分區(qū)分出一組具有相同特征的COPD 型, 即低BMI 型及肺氣腫型, 但不能通過FeNO 來分型。
目的 采用聚類分析的方法對慢性阻塞性肺疾病( COPD) 患者綜合特征的重要組成部分進(jìn)行識別及分組, 形成亞組( 即表型) , 以探討聚類分析在COPD 患者表型研究中的價值。方法 納入北京同仁醫(yī)院呼吸科的168 例COPD患者, 收集人口統(tǒng)計學(xué)資料、病程、體重指數(shù)( BMI) 、吸煙指數(shù)、急性加重頻率、合并癥等?；颊哂诜€(wěn)定期行肺功能檢查、HRCT 肺氣腫評分, 評估呼吸困難程度( MMRC 評分) , 進(jìn)行COPD 評估測試( CAT) , 測量6 分鐘步行距離。應(yīng)用SPSS13. 0 統(tǒng)計學(xué)軟件對168 例患者進(jìn)行聚類分析。結(jié)果 根據(jù)慢性阻塞性肺疾病全球策略( GOLD) 分級標(biāo)準(zhǔn), 168 例患者中GOLD 1 級5 例, 2 級75 例,3 級75 例, 4 級13 例。各級患者在性別分布、BMI、吸煙指數(shù)、高血壓、腦梗死患病率方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義( P gt; 0. 05) , 但在年齡、病程、呼吸困難評分、6 分鐘步行距離、BODE 評分、CAT 評分、冠心病患病率、急性加重頻率、肺氣腫視覺評分等方面差異具有統(tǒng)計學(xué)意義( P lt;0. 05) 。按樣本聚類的方法可將168 例患者分為3 類: 年輕/輕度組、老年/ 重度組、老年/ 中度組。GOLD 分級相同的患者可出現(xiàn)在不同的組中, 3 組之間在年齡、BMI、急性加重頻率、呼吸困難評分、CAT評分、合并癥的患病率等方面存在差異。相反, 不同GOLD 分級的患者也可出現(xiàn)在同一組中。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)肺氣腫視覺評分也是區(qū)分各類特征的重要指標(biāo), 提示肺氣腫是COPD 的一個重要表型。結(jié)論 聚類分析能最大限度地將同質(zhì)的患者歸為一類, 將不同質(zhì)的患者劃分到不同的類中, 將其用于COPD的表型研究具有一定的臨床價值
摘要： 目的 體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)主動脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞鈣化，并觀察其表型變化。 方法 使用膠原酶消化法從新鮮豬主動脈瓣膜上分離并體外原代培養(yǎng)主動脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞，行免疫熒光染色細(xì)胞鑒定。取4~8代間質(zhì)細(xì)胞，隨機分為兩組，實驗組：以含甘油磷酸、維生素C、地塞米松的鈣化培養(yǎng)基進(jìn)行鈣化誘導(dǎo)培養(yǎng)2周；對照組：以標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基培養(yǎng)2周。在光學(xué)顯微鏡下行鈣化結(jié)節(jié)計數(shù)，茜素紅染色觀察并半定量檢測鈣沉積含量；采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測間質(zhì)細(xì)胞α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）及鈣化相關(guān)因子（骨鈣素、 骨橋蛋白、核心結(jié)合因子）的基因表達(dá)。 結(jié)果 從豬主動脈瓣膜上成功分離并體外培養(yǎng)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞，α-SMA及波形蛋白（vimentin）染色陽性，血管性血友病因子（vWF）染色陰性。間質(zhì)細(xì)胞鈣化誘導(dǎo)培育2周可成功誘導(dǎo)鈣化，自發(fā)形成鈣化結(jié)節(jié)，實驗組鈣化結(jié)節(jié)(156.25±17.38個/孔vs. 2.50±1.29個/孔)和鈣沉積 (17.52±2.04 vs. 1.00±0.22) 顯著高于對照組（Plt;0.05）; 實時RT-PCR提示：實驗組αSMA、骨鈣素、骨橋蛋白、核心結(jié)合因子等表達(dá)均較對照組明顯升高（Plt;0.05）。 結(jié)論 體外誘導(dǎo)鈣化的瓣膜間質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)相對激活狀態(tài)，表型向收縮表型和成骨表型轉(zhuǎn)化，可能為瓣膜鈣化的病理基礎(chǔ)。
目的研究體外單層培養(yǎng)與藻酸鹽微球立體培養(yǎng)對人正常髓核細(xì)胞分化的影響，并探討白藜蘆醇（resveratrol，RES）恢復(fù)藻酸鹽微球立體培養(yǎng)下去分化髓核細(xì)胞表型的調(diào)節(jié)機制。 方法取6例腰椎爆裂骨折患者自愿捐贈的正常髓核組織分離培養(yǎng)髓核細(xì)胞，并行細(xì)胞鑒定；取單層培養(yǎng)的第1、3、5、7代髓核細(xì)胞分別行形態(tài)學(xué)觀察、β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase，SA-β-gal）染色觀察細(xì)胞衰老情況及甲苯胺藍(lán)染色觀察蛋白多糖表達(dá)。分別取單層培養(yǎng)和藻酸鹽微球立體培養(yǎng)的第1代髓核細(xì)胞檢測細(xì)胞增殖情況。取立體培養(yǎng)1周的第7代髓核細(xì)胞隨機分為立體培養(yǎng)空白組（A組）、RES組（B組）、沉默交配型信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1（silent mating type information regulation 2 homolog 1，SIRT1）-小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）+ RES組（C組）、陰性對照-siRNA+RES組（D組），另設(shè)置髓核細(xì)胞單層培養(yǎng)空白組（E組），行相應(yīng)培養(yǎng)后采用Western blot檢測SIRT1、聚蛋白多糖（Aggrecan）和Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)，實時熒光定量PCR檢測SIRT1 mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果細(xì)胞鑒定提示培養(yǎng)細(xì)胞為髓核細(xì)胞。形態(tài)學(xué)觀察及SA-β-gal、甲苯胺藍(lán)染色示，在體外連續(xù)單層培養(yǎng)條件下，正常髓核細(xì)胞易發(fā)生去分化，且隨著傳代次數(shù)增加趨勢愈明顯。藻酸鹽微球立體培養(yǎng)48 h內(nèi)髓核細(xì)胞增殖顯著低于單層培養(yǎng)（P lt; 0.05），但能顯著提高去分化髓核細(xì)胞SIRT1、Ⅱ型膠原與Aggrecan蛋白的表達(dá)，E組與A組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）；與A組相比，B組3種蛋白表達(dá)顯著提高（P lt; 0.05）。C組SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)均受明顯抑制，顯著低于B、D組（P lt; 0.05），Ⅱ型膠原與Aggrecan蛋白表達(dá)也顯著低于B、D組（P lt; 0.05）。 結(jié)論連續(xù)體外單層培養(yǎng)條件下，髓核細(xì)胞增殖速度較快，但在培養(yǎng)過程中易發(fā)生去分化現(xiàn)象；而在藻酸鹽微球立體培養(yǎng)條件下，RES可以恢復(fù)去分化髓核細(xì)胞表型，合成更多細(xì)胞外基質(zhì)，這一機制與SIRT1的調(diào)節(jié)有關(guān)。
目的綜述細(xì)胞老化及老化表型改變在椎間盤退行性變中的研究進(jìn)展。 方法查閱椎間盤退行性變領(lǐng)域細(xì)胞老化相關(guān)的國內(nèi)外文獻(xiàn)并回顧分析，綜述椎間盤細(xì)胞的老化現(xiàn)象、老化表型改變、老化信號激活與椎間盤退行性變的相互關(guān)系，評價抗老化治療對椎間盤退行性變的修復(fù)作用。 結(jié)果隨著機體衰老與椎間盤退行性變，椎間盤細(xì)胞通過選擇性地激活p53-p21-視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（retinoblastoma，RB）或p16INK4A-RB信號通路而老化。老化細(xì)胞的聚集不僅弱化了椎間盤的自我修復(fù)能力，同時上調(diào)表達(dá)炎性因子、基質(zhì)降解酶等老化分泌表型，從而進(jìn)一步惡化鄰近細(xì)胞賴以生存的微環(huán)境。尋找老化細(xì)胞特異性的生化標(biāo)記物是進(jìn)一步探明椎間盤細(xì)胞老化分泌表型的關(guān)鍵，安全且高效的抗老化治療依賴于對椎間盤細(xì)胞老化機制的深入認(rèn)識。 結(jié)論從細(xì)胞老化及老化表型改變角度認(rèn)識椎間盤細(xì)胞活性丟失與功能改變的病理機制，為理解椎間盤退變性變的細(xì)胞學(xué)病因提供了新思路。
目的 探討B(tài)MP-2 聯(lián)合低氧環(huán)境誘導(dǎo)BMSCs 向軟骨表型分化的可行性，并進(jìn)一步研究其生物學(xué)機制。 方法 取4 周齡健康清潔級雌性SD 大鼠骨髓采用貼壁法體外培養(yǎng)BMSCs，取第2 代細(xì)胞根據(jù)培養(yǎng)條件不同分為4 組：常氧對照組（A 組）、常氧加BMP-2 誘導(dǎo)液組（B 組）、低氧（O2 濃度3%）對照組（C 組）和低氧加BMP-2誘導(dǎo)液組（D 組）。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，培養(yǎng)7、14、21 d 阿利新藍(lán)染色檢測各組軟骨 基質(zhì)糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAG）分泌水平，21 d 時Western blot 檢測細(xì)胞內(nèi)Ⅱ型膠原和低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxiainducible factor 1α，HIF-1α）蛋白表達(dá)水平，RT-PCR檢測成軟骨、成骨以及低氧相關(guān)基因表達(dá)水平。 結(jié)果 誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d，D 組細(xì)胞變?yōu)轭悎A形，細(xì)胞密度降低，細(xì)胞周邊呈陷窩樣，基質(zhì)包裹細(xì)胞；A、B、C 組均未見上述典型變化。D 組阿利新藍(lán)染色明顯較其他組深，并隨誘導(dǎo)時間延長藍(lán)染加深，21 d 時出現(xiàn)成片深染藍(lán)色，其他組各時間點僅見散在少量的淡染藍(lán)色。Western blot 檢測D 組細(xì)胞內(nèi)Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)水平較其他組顯著增高，C、D 組HIF-1α 蛋白表達(dá)水平較A、B 組顯著增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）。RT-PCR 檢測D 組成軟骨分化相關(guān)指標(biāo)Ⅱ型膠原α1（collagen Ⅱ α1，COL2 α1）、聚集蛋白聚糖表達(dá)最高，而B 組成骨分化相關(guān)指標(biāo)COL1 α1、ALP、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 表達(dá)水平最高，C、D 組低氧相關(guān)指標(biāo)HIF-1α 較A、B 組顯著增強，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論 BMP-2 聯(lián)合低氧（O2 濃度3%）環(huán)境可以誘導(dǎo)大鼠BMSCs 向軟骨分化，并抑制其成骨分化，HIF-1α 可能是參與促軟骨生成過程中的一個重要信號分子。
目的 綜述髓核細(xì)胞表型標(biāo)記的研究進(jìn)展。 方法 廣泛查閱近年關(guān)于髓核細(xì)胞表型標(biāo)記的文獻(xiàn)，并對其進(jìn)行分析。 結(jié)果 由于不同的生物力學(xué)特性，髓核細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的形態(tài)及細(xì)胞外基質(zhì)組分如蛋白多糖與Ⅱ型膠原α1 的比率存在差異；通過髓核細(xì)胞的表面標(biāo)記（CD24）、基因標(biāo)記（低氧誘導(dǎo)因子1α、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1、基質(zhì)金屬蛋白酶、VEGF-A 等）及細(xì)胞內(nèi)各種分子標(biāo)記（角蛋白19 和磷脂酰肌醇聚糖3、配對盒1、叉頭蛋白和整聯(lián)蛋白涎蛋白等）可以初步鑒別髓核細(xì)胞。 結(jié)論 髓核細(xì)胞與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞表型標(biāo)記存在差異，但仍缺乏特異性標(biāo)記物。
目的 對體外培養(yǎng)大鼠軟骨細(xì)胞復(fù)制性老化行為進(jìn)行觀察，為進(jìn)一步研究組織工程軟骨退變機制，以及用藥物干預(yù)并逆轉(zhuǎn)其退變提供實驗參考。方法 4周齡SD大鼠，體重185～200 g，斷頸處死，分離培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，采用組織化學(xué)法檢測傳代培養(yǎng)的P1、P2、P3及P4代軟骨細(xì)胞老化相關(guān)β-半乳糖苷酶，透射電鏡觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)表達(dá)，阿力新藍(lán)染色檢測胞外基質(zhì)硫酸糖胺多糖 (sulfat-glycosaminoglycan，GAG)含量和分子結(jié)構(gòu)，RT-PCR方法檢測軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期及增殖指數(shù)（proliferative index，PI）。結(jié)果 β-半乳糖苷酶檢測：P1、P2代軟骨細(xì)胞偶見陽性染色；P3代可見少數(shù)細(xì)胞陽性染色，與P1、P2代比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；P4代與P1～P3代比較，陽性染色顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01) 。透射電靜鏡觀察：P1、P2代細(xì)胞胞漿內(nèi)細(xì)胞器較多，胞核及核仁清晰，無凋亡軟骨細(xì)胞；P3代細(xì)胞核漿比較大，胞漿內(nèi)細(xì)胞器減少，膠原網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)模糊不清；P4代細(xì)胞核漿比例增大，核固縮。P4代細(xì)胞G0/G1期含量增加（83.8％），而P1、P2及P3代分別為79.1%，79.2%，80.8%。P4代細(xì)胞PI為16．2％，P1、P2、P3代PI分別為20.9%、20.8%、19.2%。PCNA表達(dá)、GAG含量、長鏈分子百分比、Ⅱ型膠原表達(dá)減少等指標(biāo)P4代與前代比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0．01）。結(jié)論 體外培養(yǎng)的大鼠軟骨細(xì)胞P4代出現(xiàn)老化。
目的 通過觀察鹿茸多肽對白細(xì)胞介素 1β（interleukin 1β，IL-1β）誘導(dǎo)軟骨表型化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs）凋亡的影響，以優(yōu)化軟骨組織工程的種子細(xì)胞。方法 新西蘭大白兔2只，抽取其骨髓；經(jīng)密度梯度離心得到單核細(xì)胞，經(jīng)體外分離、培養(yǎng)獲得兔MSCs。用轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）將其誘導(dǎo)分化軟骨表型。將軟骨表型化MSCs隨機分成A組（空白對照組）：5%胎牛血清的αMEM培養(yǎng)液；B組（IL-1β組）：5%胎牛血清的αMEM培養(yǎng)液加入100 ng IL-1β；C組（鹿茸多肽組）：5%胎牛血清的αMEM培養(yǎng)液加入10 μg/ml鹿茸多肽作用3d后再加入100 ng IL-1β；D組（TGF-β1組）：5%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液加10 ng/ml TGF-β1作用3 d后再加入100 ng IL-1β。分別于培養(yǎng)24、48和72 h后取樣，采用透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，Annexin V法檢測細(xì)胞凋亡率，RT-PCR技術(shù)分析Caspase-3 mRNA表達(dá)水平，ELISA法檢測Caspase-3蛋白酶活性。結(jié)果 透射電鏡觀察：B組24 h后細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)開始呈塊狀凝集，分布于核膜下，核膜不規(guī)則；48 h后細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)凝集加劇；72 h后部分細(xì)胞內(nèi)的核碎片凝集成凋亡小體。各時間點C、D組細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變相對滯后，且數(shù)量較少；A組細(xì)胞結(jié)構(gòu)幾乎無明顯改變。各時間點B組MSCs凋亡率、Caspase-3 mRNA表達(dá)及蛋白酶活性逐漸增高，與A組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.01）；C、D組與B組比較則逐漸下降，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）。結(jié)論 Caspase3參與MSCs凋亡，鹿茸多肽通過減少Caspase-3 mRNA表達(dá)，并抑制其蛋白酶活性，阻止或逆轉(zhuǎn)軟骨表型化MSCs凋亡。