目的克隆人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(hVEGF)基因VEGF165片段,構(gòu)建pcDNA3.1/hVEGF165, 觀察其在COS-7細(xì)胞中的表達(dá),為基因治療缺血性心臟病的研究奠定基礎(chǔ)。方法從合法引產(chǎn)的胎兒心肌組織中提取總核糖核酸(RNA),應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法獲得hVEGF165基因,將其重組入T載體,聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法鑒定并測(cè)序,雙酶切后克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-his-B中,構(gòu)建pcDNA3.1/hVEGF165重組體。用脂質(zhì)體介導(dǎo)將其轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,蛋白印跡(Westernblotting)法檢測(cè)rhVEGF165的表達(dá)蛋白。結(jié)果用RT-PCR方法從胎兒心肌組織中獲得了正確的hVEGF165基因序列,并成功構(gòu)建pcDNA3.1/hVEGF165,且實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞的瞬時(shí)表達(dá)。結(jié)論構(gòu)建的pcDNA3.1/hVEGF165轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞COS-7能夠表達(dá)rhVEGF蛋白。
目的 通過基因工程手段從大鼠脊髓中獲取Nogo-66、NEP1-40基因并實(shí)現(xiàn)其蛋白的體外表達(dá)。 方法 從幼年大鼠的脊髓組織中，通過RT-PCR技術(shù)獲得Nogo-66、 NEP1-40基因，將目的基因通過基因連接反應(yīng)與T載體連接，重組質(zhì)粒進(jìn)行基因序列測(cè)序，構(gòu)建PQE30-GST和目的基因的高表達(dá)質(zhì)粒，異丙基βD硫代半乳糖(isopropylthiogalactoside,IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，Ni柱純化，Western-blot法檢測(cè)純化的目的蛋白。 結(jié)果 成功獲得大鼠Nogo-66、NEP1-40基因，加上兩端的酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基，大小分別為215 bp和137 bp。序列測(cè)序顯示基因突變率為0，表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建雙酶切(BamH Ⅰ-和Hind Ⅲ)可見目的基因的條帶，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得帶GST標(biāo)簽的融合蛋白Nogo-66和NEP1-40，相對(duì)分子質(zhì)量分別為33.2×103和30.3×103。蛋白純化結(jié)果理想，經(jīng)Westernblot分析證實(shí)抗原性正確。 結(jié)論 Nogo-66、NEP1-40蛋白可通過基因工程手段獲得體外高效表達(dá)，這將對(duì)其功能的研究及脊髓損傷疫苗的研究提供基礎(chǔ)。
目的 探討構(gòu)建人骨形成蛋白2（human bone morphgenetic protein 2，hBMP-2）真核表達(dá)載體的方法。 方法 由人成骨肉瘤細(xì)胞中提取細(xì)胞總RNA，利用RT-PCR方法擴(kuò)增獲得hBMP-2基因cDNA，將基因片斷重組到pGEM-T質(zhì)粒中構(gòu)建pGEMT- hBMP-2重組質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α后篩選陽性克隆，利用限制性酶切和DNA序列分析鑒定重組質(zhì)粒。分別用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切pGEM-T- hBMP-2 質(zhì)粒和pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體，將克隆載體中hBMP基因重組到pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體 ，提取質(zhì)粒作酶切電泳、PCR鑒定及DNA測(cè)序。 結(jié)果 人骨肉瘤細(xì)胞中經(jīng)RT-PCR得到1.2 kbp的hBMP-2擴(kuò)增條帶，重組質(zhì)粒pGEM-T-hBMP-2經(jīng)酶切電泳可見1.2 kbp的hBMP-2條帶和4.0 kbp的載體片斷；pcDNA3.1-hBMP-2 質(zhì)粒經(jīng)酶切電泳可見1.2 kbp的hBMP2條帶和5.0 kbp的載體片斷，重組質(zhì)粒酶譜分析與預(yù)期一致；DNA序列分析測(cè)序結(jié)果校對(duì)后經(jīng)BLAST分析，表明核酸序列與Gene Bank中和hBMP-2 的mRNA序列完全吻合。 結(jié)論 通過此方法能成功克隆獲得hBMP-2基因，并構(gòu)建其真核表達(dá)載體。
目的 構(gòu)建β淀粉樣前體蛋白裂解酶（βsite amyloid precursor protein cleaving enzyme, BACE）基因的真核表達(dá)載體，為修復(fù)阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)損傷神經(jīng)元奠定基礎(chǔ)。方法 采用RT-PCR 方法，從人的成神經(jīng)細(xì)胞瘤的總cDNA中，擴(kuò)增出1.5 kb 的BACE cDNA片段，再用BamHI和XhoI雙酶切后定向克隆到真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1中，用限制性內(nèi)切酶酶切分析和DNA序列分析鑒定重組質(zhì)粒；以免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)BACE基因的表達(dá)情況。結(jié)果 人BACE基因的cDNA已克隆到真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1質(zhì)粒中；經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后，并由潮霉素進(jìn)行篩選，可見轉(zhuǎn)染細(xì)胞胞漿中和胞膜上有較高量的BACE蛋白表達(dá)。結(jié)論 成功構(gòu)建了pcDNA3.1-BACE的真核表達(dá)載體，為研究BACE基因在AD發(fā)病機(jī)制中的作用及抑制BACE，為治療AD奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
目的 構(gòu)建人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)真核表達(dá)質(zhì)粒，研究其在體內(nèi)外的表達(dá)。方法 通過基因克隆技術(shù)，構(gòu)建并大量制備pcDNA3.1/myc-His(-)C-bFGF真核表達(dá)體系，RT-PCR和細(xì)胞免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)體外瞬時(shí)表達(dá)情況；直流電脈沖介導(dǎo)重組質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-His(-)C-bFGF和pCD2-血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子121(vascular endothelial growth factor, VEGF121)在兔頸部肌肉瓣內(nèi)轉(zhuǎn)移并表達(dá)，測(cè)定其促血管生成的生物學(xué)效應(yīng)。結(jié)果 構(gòu)建的pcDNA3.1/myc-His(-)C-bFGF真核表達(dá)體系成功轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)HeLa細(xì)胞，目的基因在mRNA水平和蛋白水平均有表達(dá)。pcDNA3.1/myc-His(-)C-bFGF和pCD2-VEGF121重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染在體肌瓣，獲得外源基因高水平表達(dá)。轉(zhuǎn)基因肌肉發(fā)生血管增生、血流增強(qiáng)的生物學(xué)效應(yīng)。結(jié)論 構(gòu)建了人bFGF真核表達(dá)質(zhì)粒，并可在體內(nèi)外順利表達(dá)，為進(jìn)一步組織移植或組織工程基因治療研究奠定了基礎(chǔ)。
目的克隆大鼠galectin-9基因全長(zhǎng)cDNA，構(gòu)建含大鼠galectin-9基因的重組腺病毒載體，并予以鑒定。方法從大鼠的肝臟組織中用RT-PCR的方法克隆擴(kuò)增大鼠galectin-9基因，再定向插入到帶NotⅠ和HindⅢ酶切的pDC316-GFP穿梭質(zhì)粒中，獲得穿梭質(zhì)粒pDC316-GFP-galectin-9。經(jīng)PCR、NotⅠ和HindⅢ酶切及測(cè)序鑒定后，用脂質(zhì)體將穿梭質(zhì)粒pDC316-GFP-galectin-9與腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGlox△E1.3Cre共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞。經(jīng)位點(diǎn)特異性重組獲得含目的基因的重組腺病毒Ad5-galectin-9，行PCR鑒定，經(jīng)HEK-293細(xì)胞擴(kuò)增及純化制備高滴度病毒液，用細(xì)胞培養(yǎng)方法測(cè)定病毒TCID50滴度。結(jié)果 PCR、酶切及測(cè)序證實(shí)穿梭質(zhì)粒構(gòu)建正確，PCR鑒定證實(shí)大鼠galectin-9基因重組腺病毒載體構(gòu)建正確，病毒的感染滴度為1.4×109 U/ml。結(jié)論成功構(gòu)建了含大鼠galectin-9基因的重組腺病毒表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究大鼠galectin-9基因的功能奠定了基礎(chǔ)。
目的構(gòu)建人CD59真核表達(dá)載體pSecTag2/HygroB-CD59，并利用殼聚糖（chitosan）組裝成納米微粒復(fù)合體，轉(zhuǎn)染小鼠NIH3T3細(xì)胞。方法應(yīng)用PCR方法，從CD59-pGEM-T Easy Vector克隆相關(guān)的DNA序列，插入到具有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的真核表達(dá)載體pSecTag2/HygroB中，構(gòu)建pSecTag2/HygroB-CD59真核表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行酶切鑒定及序列測(cè)定。利用殼聚糖包裹質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染小鼠NIH3T3細(xì)胞，并用抗CD59抗體對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果CD59基因大小為312 bp，與Genbank中記載的人CD59 cDNA序列結(jié)果完全一致。利用殼聚糖-CD59納米微粒轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞24 h后，免疫組織化學(xué)染色顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞CD59呈彌漫性胞漿陽性。結(jié)論成功構(gòu)建了人CD59真核表達(dá)載體并通過殼聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，為進(jìn)一步探討及研究轉(zhuǎn)基因肝臟奠定了基礎(chǔ)。